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文檔簡介
1、鐮刀菌和黃曲霉菌是世界上侵染小麥、玉米、水稻、花生等多種糧食和油料作物的病原真菌,不僅降低作物品質(zhì)和產(chǎn)量,造成巨大的經(jīng)濟損失,還在侵染植物過程中產(chǎn)生多種真菌毒素,人、畜誤食后會引起中毒,嚴重時可致癌癥和死亡。中國是農(nóng)業(yè)大國,糧食的生產(chǎn)和品質(zhì)關(guān)系著國家的經(jīng)濟發(fā)展和社會穩(wěn)定。因此,開展鐮刀菌和黃曲霉菌控制技術(shù)研究,對于保障我國糧食穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)和食品安全,具有重要意義。
由于天然抗性資源匱乏,已鑒定和開發(fā)的抗病資源有限,傳統(tǒng)育種方法未能
2、有效控制這些病原菌及其毒素的危害。長期以來,鐮刀菌和黃曲霉菌的防治以化學殺菌劑為主,導(dǎo)致了嚴重的環(huán)境污染和生態(tài)環(huán)境問題,誘發(fā)了病原菌的抗藥性和產(chǎn)毒量的增強。所以,開發(fā)對生態(tài)和環(huán)境安全的生物防治技術(shù),具有廣泛的應(yīng)用前景。為此,我們分別以禾谷鐮刀菌和黃曲霉菌為靶標病原真菌,通過微生物源生防菌株的分離、篩選、代謝物解析以及作用機理研究,獲得多個高活性拮抗菌,鑒定了主要抑菌物質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)和作用靶點,并用于田間及儲藏期的病原菌防治。
以
3、鐮刀菌為靶標病原菌取得的主要研究結(jié)果如下:
1.抑制鐮刀菌的芽孢桿菌篩選。從中國9個省的不同生態(tài)環(huán)境中采集樣品160份,分離得到1809個菌株,其中12個菌株能顯著抑制禾谷鐮刀菌生長,進一步用于孢子萌發(fā)、苗期接種、田間單花接種和噴霧接種等拮抗作用分析,最終獲得具有高效抑菌活性的3株芽孢桿菌(S76-3,DM-3,DK-1),其孢子萌發(fā)抑制率97%,小麥苗腐病抑制率為46%-57%,小麥穗腐病的抑制率為67%-80%。篩選得到的
4、高效菌株S76-3用于鐮刀菌的田間防治和抑菌機理研究;
2.拮抗菌及其無菌上清液抑菌活性測定。以抑菌活性最強的解淀粉芽孢桿菌S76-3為材料,以活菌數(shù)為指標優(yōu)化發(fā)酵條件,篩選得到一個最優(yōu)培養(yǎng)基(紅糖23.3g/L,豆粉11.1g/L, CaCO34.9g/L, KNO38g/L, KH2PO40.5g/L, K2HPO41.2g/L,MgSO4·7H2O5g/L,NaC13g/L),發(fā)酵后活菌數(shù)達1010/ml以上;收集發(fā)酵液
5、菌體,添加助劑后制備可濕性粉劑,活菌數(shù)達109/g以上。S76-3可濕性粉劑與無菌上清液稀釋后的田間試驗表明,S76-3菌體和無菌上清液在不同年份和品種中均可有效防治小麥赤霉病,以2013年為例,無菌上清液處理后的病情指數(shù)可降低52%,小麥籽粒毒素含量降低76%,顯著優(yōu)于常用化學殺菌劑多菌靈;S76-3菌體處理可降低13%的病情指數(shù)的,43%的毒素,明顯弱于多菌靈;
3.抑菌物質(zhì)化學結(jié)構(gòu)解析。S76-3菌株基因組測序結(jié)合PCR
6、分析表明,該菌株含有脂肽類物質(zhì)編碼基因;薄層色譜和液相色譜質(zhì)譜連用儀分析證實,S76-3菌株主要產(chǎn)生依枯草菌素、豐原素和表面活性素;進一步將這3種物質(zhì)經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離和質(zhì)譜分析(ESI-CID-MS)表明,S76-3產(chǎn)生的脂肽物質(zhì)為依枯草菌素A、豐原素A/B和表面活性素,每類物質(zhì)分別含有2-4種同系物;
4.脂肽類物質(zhì)抑菌機理。利用高效液相收集上述3種脂肽物質(zhì),配置成不同濃度后用于體外抑制鐮刀菌活性以及抑菌機理研究,結(jié)果表明,表
7、面活性素不具有抑菌活性,依枯草菌素A和豐原素A可高效抑菌鐮刀菌;光學顯微鏡分析表明,這2種物質(zhì)均可破壞鐮刀菌菌絲和孢子結(jié)構(gòu),導(dǎo)致真菌細胞膨大后喪失活性;透射電鏡分析顯示,這2種物質(zhì)主要引起真菌細胞壁穿孔和細胞膜破裂,導(dǎo)致細胞死亡;實時顯微跟蹤分析表明,依枯草菌素A主要作用于真菌菌絲的側(cè)端導(dǎo)致凸起,豐原素主要作用于菌絲生長點,使其異常膨大。
以黃曲霉菌為靶標病原菌取得的主要研究結(jié)果如下:
1.產(chǎn)氣拮抗菌篩選與鑒定。從1
8、00余株海洋細菌中,通過雙皿對扣抑菌試驗,篩選獲得可產(chǎn)生抑菌性揮發(fā)氣體、對黃曲霉菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制率高于80%的細菌5株,包括1株假單胞菌(Pseudomonas sp.)、1株希瓦氏菌YM8(Shewanella sp.)、2株葡萄球菌(Staphylococcus sp.)和1株微球菌(Micrococcus sp.),其中海藻希瓦氏菌YM8的抑菌活性最強,對黃曲霉菌、鐮刀菌等9種重要植物病原真菌的抑制率均為100%。以海藻
9、希瓦氏菌YM8為材料進行儲藏期黃曲霉菌及其毒素防治和抑菌機理研究;
2.抑菌氣體的化學結(jié)構(gòu)解析。利用氣相色譜質(zhì)譜連用儀(GC-MS)對YM8產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體物質(zhì)進行分析,結(jié)果表明,YM8可產(chǎn)生15種揮發(fā)性物質(zhì),包括芳香族,烷類,硫化物,烯醇類,噁唑類,蒽類,酯類以及酚類等8類物質(zhì),其中二甲基三硫豐度最高,相對含量達14.195%。從15種物質(zhì)中選取相似度高于70%,相對含量高于0.5%的6種物質(zhì)進行抑菌試驗,結(jié)果表明,2,4-
10、二叔丁基苯酚和二甲基三硫的抑菌作用最強,分別在濃度為100μg/L和200μg/L(物質(zhì)重量/空間體積)時可完全抑制黃曲霉菌絲的生長和孢子萌發(fā);其余4種物質(zhì),2,4-二甲基噁唑、2-十二烷醇、丁基羥基甲苯和壬烷也具有抑制黃曲霉菌的作用。其中2,4-二甲基噁唑和2-十二烷醇為首次報道對病原真菌具有抑制作用。豐度最高、抑菌活性最強的二甲基三硫,在YM8菌株的抑菌活性中具有重要作用;
3.產(chǎn)氣菌對糧食中黃曲霉抑菌效率分析。將YM8菌
11、與接種黃曲霉孢子的花生、玉米籽粒共培養(yǎng)后檢測結(jié)果表明,對照組樣品中水活度越高發(fā)病率越高,毒素含量越大。高水活度下花生樣品發(fā)病率為100%,毒素含量為54μg/g,玉米樣品發(fā)病率為100%,毒素量為5.59μg/g,與此相比,YM8菌株可完全抑制花生、玉米籽粒黃曲霉菌生長和毒素合成,在3種水活度下的黃曲霉菌與產(chǎn)毒量均為0。掃描電子顯微鏡觀察,未經(jīng)YM8處理的花生,表面覆蓋大量黃曲霉菌絲和孢子;而YM8處理組的花生表面,孢子不能萌發(fā),沒有菌
12、絲及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu),少量異常孢子形狀畸形,表面干癟皺縮,失去侵染和萌發(fā)能力;
4.YM8序列測定及BAC文庫構(gòu)建。YM8全基因組測序結(jié)果表明,該菌株基因組大小為4-5 M bp;提取YM8菌株DNA構(gòu)建大腸桿菌BAC文庫,獲得含有1152個克隆(片段長度為60 kb左右)的BAC文庫用于后續(xù)克隆二甲基三硫編碼基因。YM8菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中抑菌作用較弱,通過在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同氨基酸,發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸和半胱氨酸能顯著提高抑菌活性,說明這
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