黃曲霉菌特異單鏈抗體及其基因的分離鑒定和應(yīng)用.pdf

1、黃曲霉菌（Aspergillusflavus）是一種重要的植物病原真菌，造成玉米、花生、棉花等多種農(nóng)作物的減產(chǎn)和糧食的霉變，導(dǎo)致重大的經(jīng)濟(jì)損失。黃曲霉菌也是一種重要的人和動(dòng)物致病菌引起嚴(yán)重的曲霉病。黃曲霉菌和寄生曲霉菌（Aspergillusparasiticus）產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素(aflatoxin)是一種劇毒的真菌毒素，具有強(qiáng)烈地致癌和致畸作用。被黃曲霉菌污染的農(nóng)產(chǎn)品中通常有大量的黃曲霉毒素殘留，被人和動(dòng)物誤食會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重

2、的中毒事件，長期攝入會(huì)誘發(fā)肝癌等疾病，嚴(yán)重威脅人和動(dòng)物的健康。因此對(duì)黃曲霉菌進(jìn)行快速、靈敏地檢測對(duì)于預(yù)防黃曲霉菌引起的動(dòng)植物病害，監(jiān)測黃曲霉毒素的污染具有重要的意義。
　　免疫學(xué)檢測技術(shù)利用了抗體和抗原之間的特異性互作，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種病原菌的快速診斷。傳統(tǒng)的免疫學(xué)檢測方法主要利用多克隆抗體和單克隆抗體，但這2種抗體的制備依賴于動(dòng)物免疫和雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)，生產(chǎn)成本較高。利用噬菌體展示技術(shù)可以從抗體文庫中篩選到高親和力單鏈抗體

3、，并且同時(shí)獲得抗體的編碼基因。單鏈抗體具有易于原核表達(dá)和基因工程改造等優(yōu)點(diǎn)，在免疫學(xué)檢測領(lǐng)域中有顯著的優(yōu)勢。本研究以黃曲霉菌細(xì)胞壁蛋白為靶標(biāo)，選到了高親和力單鏈抗體，所取得的主要成果如下:
　　1.將黃曲霉細(xì)胞壁蛋白免疫小鼠，通過雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)篩選到了4株黃曲霉菌特異單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞。對(duì)4種從小鼠腹水中純化的單克隆抗體進(jìn)行了ELISA分析，結(jié)果表明mAb2A8抗體對(duì)黃曲霉細(xì)胞壁蛋白的親和力最高，可以用于免疫學(xué)檢測。

4、　　2.將黃曲霉細(xì)胞壁蛋白免疫雞，構(gòu)建了庫容量為1.2×107的雞源單鏈抗體文庫，并利用噬菌體展示技術(shù)對(duì)抗體文庫進(jìn)行了篩選。通過表達(dá)ELISA從篩選后的單鏈抗體文庫中鑒定出了35個(gè)陽性克隆，對(duì)所屬的4種類型高親和力抗體AfSA4、AfSA5、AfSA8和AfSD10進(jìn)行原核表達(dá)和純化。
　　3.對(duì)篩選到的單鏈抗體氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明抗體CDR區(qū)序列的組成和長度存在較大差異。間接ELISA分析表明AfSA4對(duì)黃曲霉菌和寄生曲

5、霉菌的親和力最高。對(duì)AfSA4、AfSA5、AfSA8和AfSD10的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)構(gòu)比較分析表明AfSA4的L-CDR2和H-CDR3結(jié)構(gòu)域之間存在氫鍵等緊密的相互作用，該部位獨(dú)特的致密空間結(jié)構(gòu)可能與AfSA4的高親和力密切相關(guān)。免疫熒光分析表明AfSA4可以與黃曲霉和寄生曲霉細(xì)胞壁表面結(jié)合，而AfSA5、AfSA8和AfSD10不能識(shí)別細(xì)胞壁表面。免疫印跡分析也迸一步證明了不同單鏈抗體之間存在抗原識(shí)別特性的差異。
　　

6、4.利用phageELISA方法對(duì)淘選后的抗體文庫進(jìn)行鑒定，對(duì)篩選到的陽性克隆序列進(jìn)行了分析，并與表達(dá)ELISA的鑒定結(jié)果進(jìn)行比較。從中篩選到了高親和力單鏈抗體AfPD12，并進(jìn)行原核表達(dá)和純化。免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明AfPD12識(shí)別黃曲霉和寄生曲霉細(xì)胞壁表面抗原。免疫印跡實(shí)驗(yàn)證明AfPD12識(shí)別細(xì)胞壁蛋白。
　　5.將AfSA4和AfPD12與堿性磷酸酶(AP)構(gòu)建成融合蛋白AfSA4-AP和AfPD12-AP，并進(jìn)行原核表達(dá)和純化。

7、ELISA和免疫印跡分析表明scFv抗體和scFv-AP融合蛋白具有相同抗原識(shí)別特性，特異性識(shí)別曲霉屬病原真菌。表面等離子共振(SPR)分析表明AfSA4-AP親和力比AfSA4提高了約6倍，AfPD12-AP親和力比AfPD12提高了約14倍。間接ELISA實(shí)驗(yàn)表明scFv-AP融合蛋白檢測抗原的靈敏度更高。
　　6.將AfPD12與生物素化標(biāo)簽蛋白構(gòu)建了Bio-AfPD12融合蛋白，并進(jìn)行原核表達(dá)和純化。Westernblot

8、分析表明鏈霉親和素特異性識(shí)別原核表達(dá)的Bio-AfPD12證明Bio-AfPD12被成功生物素化。間接ELISA實(shí)驗(yàn)表明Bio-AfPD12能夠用于檢測黃曲霉菌和寄生曲霉菌。
　　7.利用包被抗體mAb2A8和檢測抗體AfSA4-AP建立了夾心ELISA(ds-ELISA)檢測體系，可以同時(shí)對(duì)黃曲霉菌和寄生曲霉菌進(jìn)行高靈敏度檢測，對(duì)兩者的最低檢測限達(dá)到10-3μg/mL。在玉米和花生基質(zhì)中對(duì)兩種真菌檢測的靈敏度達(dá)到1μg/g。該檢

9、測方法對(duì)健康的玉米、花生材料和非曲霉屬的常見植物病原真菌沒有交叉反應(yīng)，可以用于對(duì)黃曲霉毒素產(chǎn)生菌的免疫學(xué)檢測。
　　8.利用包被抗體AfPD12和檢測抗體AfPD12-AP建立的ds-ELISA可以檢測黃曲霉菌和寄生曲霉菌，靈敏度達(dá)到10-2μg/mL，該方法可以避免對(duì)單克隆抗體的使用。利用AfPD12和Bio-AfPD12建立了夾心熒光免疫吸附(ds-FLISA)檢測方法，對(duì)黃曲霉菌和寄生曲霉菌的檢測靈敏度為10-1μg/mL。