siRNA沉默SUMO-1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞SMMC-7721Bcl-2及c-myc表達(dá)的影響.pdf

1、目的:SUMO-1基因調(diào)節(jié)許多和癌癥發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的蛋白的功能,和癌癥的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn),在肝癌細(xì)胞株SMMC-7721及臨床肝癌標(biāo)本中SUMO-1基因明顯高表達(dá),進(jìn)一步提示SUMO-1基因和肝癌的發(fā)生相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究siRNA沉默人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 SUMO-1基因表達(dá)的效果及SUMO-1基因沉默后對(duì)SMMC-7721 bcl-2及c-myc基因表達(dá)的影響。
　　 方法:用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染待篩查的三對(duì)

2、人工合成的針對(duì)人SUMO-1基因的siRNA片段和空白對(duì)照這四組細(xì)胞,轉(zhuǎn)染終濃度為100nM,在轉(zhuǎn)染后24、48、72小時(shí)分別提取RNA及總蛋白,采用RT-PCR及Western Blot檢測(cè)SUMO-1基因的表達(dá),篩查出有效SUMO-1基因siRNA片段。實(shí)驗(yàn)分四組,有效的SUMO-1基因siRNA組,陰性對(duì)照組,LipofectamineTM2000組,并用與前三組具有相同遺傳背景和代數(shù)的SMMC-7721細(xì)胞作為未處理細(xì)胞組。用脂

3、質(zhì)體轉(zhuǎn)染法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染四組細(xì)胞。提取各組細(xì)胞總RNA,合成cDNA,用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)四組細(xì)胞中SUMO-1、Bcl-2及c-myc表達(dá)情況。使用蛋白抽提液分別提取四組細(xì)胞的總蛋白,使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定蛋白濃度,Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中SUMO-1、Bcl-2及c-myc表達(dá)量變化。
　　 結(jié)果:1、實(shí)驗(yàn)顯示靶序列為:5-CAAGAAACTCAAAGAATCA-3的siRNA沉默效果最好,24小時(shí)RT-PC

4、R測(cè)得沉默效果為9.80％,48小時(shí)沉默效果為73.43％,72小時(shí)沉默效果為46.56％,其中48小時(shí)沉默效果達(dá)到實(shí)驗(yàn)的要求。Western Blot檢測(cè)SUMO-1蛋白的表達(dá)變化和RT-PCR的變化規(guī)律一致。2、在siRNA致SUMO-1基因沉默后Bcl-2及c-myc基因在SMMC7721中的表達(dá)也明顯下調(diào),而且變化規(guī)律和SUMO-1表達(dá)水平一致,差別明顯(P<0.001)。
　　 結(jié)論:siRNA是一種理想的沉默SMMC