轉(zhuǎn)錄因子GATA-3在大鼠單側(cè)腎臟梗阻模型中的表達(dá).pdf

1、研究顯示腎間質(zhì)病變與慢性腎功能衰竭進(jìn)展關(guān)系密切，腎間質(zhì)纖維化幾乎是各種腎臟疾病進(jìn)展到終末期的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)。研究其病理過程和發(fā)生機(jī)制，尋找延緩和阻斷腎臟纖維化新靶標(biāo)，是目前國內(nèi)外腎臟病研究的熱點(diǎn)方向。其中腎臟纖維化過程中，多種細(xì)胞因子和生物活性物質(zhì)參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展：轉(zhuǎn)化生長因子等纖維化的正性調(diào)節(jié)因子，及肝細(xì)胞生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白等纖維化的負(fù)向調(diào)節(jié)因子通過生物信號傳導(dǎo)機(jī)制鏈接起來，形成完善的反饋系統(tǒng)，調(diào)節(jié)機(jī)體的病理生

2、理過程。但研究得最多和最為成熟的是轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1在腎臟纖維化中的作用機(jī)制。 而纖維化最顯著特征是肌成纖維細(xì)胞的增生和細(xì)胞外基質(zhì)（extracelluarmatrix，ECM）的過度沉積?；旧媳憩F(xiàn)出相似的特征，即大量的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。腎纖維化的細(xì)胞機(jī)制即是成纖維細(xì)胞激活為肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，MF），腎間質(zhì)纖維化的主要特征是出現(xiàn)MF，MF是腎間質(zhì)纖維化中產(chǎn)生基質(zhì)蛋白的主要效應(yīng)細(xì)胞。腎纖

3、維化中，MF可來源于：（1）腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞；（2）血管平滑肌細(xì)胞；（3）腎小管上皮細(xì)胞。其中腎小管上皮細(xì)胞是MF的主要來源。纖維蛋白形成的自分泌過程和成纖維細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞來源的TGF-β1，持續(xù)刺激上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為間充質(zhì)細(xì)胞（epithelial-to-mesenchymal transition EMT），這成為纖維化過程中的一個(gè)重要機(jī)制。 所以腎臟纖維化過程中TGF-β1成為公認(rèn)的致纖維化因子：其活化過程主要是與細(xì)胞膜

4、表面的TGF-βⅡ型受體結(jié)合，形成二元復(fù)合物，TGF-βⅠ型受體識別并結(jié)合該二元復(fù)合物?；罨腡GF-βⅠ型受體進(jìn)一步作用于細(xì)胞內(nèi)的下游分子是途徑限制性Smad蛋白（Smad2和Smad3），使TGF-β的信號向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)；通過和受體間的相互作用，TGF-β1誘導(dǎo)Smad蛋白磷酸化其下游信號分子Smad2/2及Smad2/3，后者與Smad4形成復(fù)合體，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。Smad蛋白是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，依據(jù)結(jié)構(gòu)和功能分為三型，即特異型

5、Smads（R. Smads），包括Smad1、2、3、5和8；公共調(diào)節(jié)型Smads（C. Smads），即Smad4；抑制型Smads（Ⅰ. Smads），包括Smad6、7。其中Ⅰ.Smad具有負(fù)調(diào)控作用，在磷酸化的R.Smad和Smad4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下Ⅰ.Smad表達(dá)增高，而Ⅰ.Smad通過其結(jié)構(gòu)域與活化的TGF-βⅠ型受體結(jié)合，使R.Smad不能與TGF-βⅠ型受體結(jié)合，從而抑制R.Smad磷酸化，阻止受體復(fù)合物的形成及轉(zhuǎn)位入核；

6、也可通過一些調(diào)節(jié)蛋白如Smad泛素調(diào)節(jié)因子降解TGF-βⅠ型受體進(jìn)而抑制信號傳導(dǎo)。 Smad蛋白2和3在人近端小管上皮細(xì)胞調(diào)節(jié)TGF-β1誘導(dǎo)的促纖維化作用并不相同，利用RNA干擾技術(shù)分別沉默Smad蛋白2和3，發(fā)現(xiàn)TGF-β1處理過的人近端小管上皮細(xì)胞結(jié)締組織生長因子（CTGF），基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和α平滑肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá)上調(diào)，而上皮細(xì)胞鈣粘蛋白表達(dá)下調(diào)。TGF-β1誘導(dǎo)的CTGF表達(dá)上調(diào)和上皮細(xì)胞鈣

7、粘連蛋白下調(diào)具有Smad3依賴性，MMP-2上調(diào)依賴于Smad2；α-SMA的表達(dá)則依賴兩者的聯(lián)合作用。也有研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞生長因子通過阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程抑制纖維化形成，肝細(xì)胞生長因子對TGF-β1介導(dǎo)的Smad2蛋白磷酸化和隨后的核轉(zhuǎn)位過程沒有影響，對抑制性蛋白Smad6和7的表達(dá)也不起作用，它是通過特異性誘導(dǎo)Smad蛋白轉(zhuǎn)錄輔阻遏物SnoN和TG交互因子的表達(dá)而抑制Smad蛋白轉(zhuǎn)錄，這個(gè)發(fā)現(xiàn)說明在肝細(xì)胞生長因子受體酪氨酸

8、激酶和TGF-β1受體絲氨酸-蘇氨酸激酶之間存在一個(gè)新的信號活化過程，也說明抑制Smad蛋白轉(zhuǎn)錄修飾因子的表達(dá)也是治療腎臟纖維化一個(gè)可行的策略。 目前關(guān)于TGF-β的研究很多是從它的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑入手的，目前研究比較多的信號系統(tǒng)包括Smad信號通路、P38 MAPK信號通路、ERK信號通路等，其中Smad信號通路是其中研究比較透徹也是最為重要的信號通路。其中在Smad信號通路中發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（BMP-7）介導(dǎo)了腎臟負(fù)向調(diào)節(jié)

9、過程，在腎臟發(fā)育過程中，BMP-7廣泛表達(dá)于各種腎臟細(xì)胞中，主要表達(dá)于集合管、遠(yuǎn)端腎小管、髓袢升支厚壁段和腎小球足細(xì)胞，BMP-7通過旁分泌和自分泌方式與腎小球和腎小管的Ⅱ型受體結(jié)合后再與Ⅰ型受體結(jié)合，使Ⅰ型受體磷酸化而作用于信號分子Smad1和Smad5，使Smad1/5磷酸化及與Smad4結(jié)合成復(fù)合體，移位到細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄，引起相應(yīng)的生物效應(yīng)。BMP-7介導(dǎo)的信號活化smad1、5和8，而TGF-β活化Smad2和3。然后

10、這些活化的Smads作用于Smad4，繼而這種復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄。TGF-β和BMP-7的信號通路通過正向和負(fù)向的調(diào)節(jié)機(jī)制緊密聯(lián)系在一起：其中一個(gè)很重要的負(fù)向反饋機(jī)制為抑制性Smads（Smad6/7）蛋白的產(chǎn)生。Smad6優(yōu)先抑制BMP的信號通路，Smad7則抑制TGF-β/activin的信號通路。Smad7通過蛋白酶體家族成員E3-ubiquitin酶結(jié)合產(chǎn)生遍在蛋白化作用和降解TGF-β受體發(fā)揮作用；同時(shí)還

11、阻斷了Smad2和Smad3蛋白的磷酸化，使得TGF-β的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程受阻，成為TGF-β的負(fù)反饋機(jī)制環(huán)路。減少Smad7蛋白的表達(dá)在單側(cè)輸尿管梗阻模型中導(dǎo)致了小管間質(zhì)性的纖維化。TGF-β通過Smad3/4，AP-1，SP1，和TFE3調(diào)節(jié)的Smad蛋白結(jié)合位點(diǎn)誘導(dǎo)Smad7的表達(dá)；BMP-7則是通過多重的BMP反應(yīng)原件（BRE）誘導(dǎo)Smad7的表達(dá)。其中有兩個(gè)低親和力的位點(diǎn)：BRE-1/2在BMP高濃度是被激活，還有一個(gè)高親和力的位

12、點(diǎn)Ⅰ-BRE在BMP低濃度時(shí)就可被激活。BRE-1/2和Smad1/4復(fù)合物結(jié)合、Ⅰ-BRE和Smad1/4/GATA結(jié)合。這提示轉(zhuǎn)錄因子GATA可能增強(qiáng)Smad7介導(dǎo)的阻斷TGF-β信號通路過程，同時(shí)在BMP低濃度時(shí)就誘導(dǎo)Smad7的產(chǎn)生從而啟動(dòng)腎臟纖維化負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。目前國內(nèi)和國際上關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的研究主要集中在肺臟及肝臟等器官上，鄧群益等通過對大鼠哮喘模型的研究發(fā)現(xiàn)：GATA-3反義寡核苷酸能特異性地抑制GATA-3基

13、因的表達(dá)，減輕氣道炎癥反應(yīng)。American Journal of Pathology上的一篇文獻(xiàn)進(jìn)一步支持了該理論，這篇文獻(xiàn)提示GATA-3的過表達(dá)增加了肺臟纖維化的發(fā)展過程，可能是通過減少了干擾素-r的產(chǎn)生而發(fā)揮作用，但是關(guān)于GATA-3在腎臟組織的表達(dá)情況及其對腎臟纖維化進(jìn)程中信號通路的影響國內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道，對其他纖維化因子TGF-β、BMP-7的影響也未進(jìn)一步探究；所以本研究利用GATA-3反義寡核苷酸在基因水平上封閉GATA

14、的表達(dá)，在基因和組織水平上檢測GATA-3的表達(dá)水平的改變情況，觀察BMP-7和Smad7的表達(dá)變化，探討其中的機(jī)制，以便為纖維化疾病的治療和研究提供有益的啟示。 目的： 1.觀察在單側(cè)腎臟梗阻模型中轉(zhuǎn)錄因子GATA-3在不同處理因素大鼠腎臟中的表達(dá)情況，了解它在腎臟纖維化進(jìn)程的作用； 2.在動(dòng)物水平上初步探討轉(zhuǎn)錄因子GATA-3反義寡核苷酸藥物的干預(yù)意義； 研究方法： 1.將36只雄性SPF級W

15、istar大鼠隨機(jī)分為單側(cè)輸尿管梗阻組（Unilateral Ureteral Obstruction group UUO）和正常對照組，單側(cè)輸尿管梗阻組按照處理因素再分為GATA-反義寡核苷酸組（antisense oligonucleotide group AS），GATA-3無意義寡核苷酸組（nonsen3 se oligonucleotide group NS）和生理鹽水組，每組各6只。正常對照組18只大鼠采取同樣的分組方法。分

16、別在試驗(yàn)第1、7、14d處死每小組2只大鼠，HE和Masson染色觀察腎臟纖維化的病理變化并評估纖維化程度。 2.采用SABC法檢測GATA-3、Smad7、BMP-7、TGF-β1的陽性表達(dá)情況并統(tǒng)計(jì)面積。 3.RT-PCR方法觀察大鼠腎臟組織GATA-3及Smad7 mRNA表達(dá)同時(shí)計(jì)算灰度值。 4.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)，采用完全隨機(jī)分組多因素析因設(shè)計(jì)

17、和方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，相關(guān)性分析用Sperrman相關(guān)系數(shù)進(jìn)行分析。 結(jié)論： 1.在腎臟纖維化過程中GATA-3在其中的信號通路中也發(fā)揮了作用； 2.反義寡核苷酸通過封閉GATA基因的表達(dá)，阻斷高親和力位點(diǎn)Ⅰ-BRE和BRESmad1/4/GATA的結(jié)合，減少BMP-7誘導(dǎo)的Smad7表達(dá)； 3.轉(zhuǎn)錄因子GATA-3反義寡核苷酸經(jīng)過反復(fù)和長時(shí)間的給藥基本上達(dá)到了有效的藥物濃度，并且和GATA-3的結(jié)