芳香開(kāi)竅法抗睡眠剝奪作用的實(shí)驗(yàn)研究及大鼠睡眠剝奪自動(dòng)記錄儀的研制.pdf

1、目的：睡眠剝奪是指機(jī)體由于自身生理、病理因素或環(huán)境的影響而喪失了生理所需睡眠量的狀態(tài)。在現(xiàn)代社會(huì)，隨著生活節(jié)奏的加快和特殊部門(mén)工作的需要，睡眠剝奪日益成為有害健康的普遍現(xiàn)象。目前，臨床常用的睡眠剝奪對(duì)抗藥物多數(shù)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物，長(zhǎng)期或大量使用會(huì)有多種不良后果，而且使用多受到管制。為此，在對(duì)睡眠生理功能、睡眠剝奪的不良后果、現(xiàn)有促醒藥物之優(yōu)劣以及中醫(yī)藥相關(guān)理論進(jìn)行分析和研究之后，我們研制了以石菖蒲和冰片為主要成分的新型中藥促醒劑—芳香開(kāi)

2、竅滴鼻劑。同時(shí)，為解決大鼠睡眠剝奪實(shí)驗(yàn)時(shí)需人工記錄落水次數(shù)的問(wèn)題，發(fā)明設(shè)計(jì)了新型應(yīng)用儀器—大鼠睡眠剝奪自動(dòng)記錄儀。本論文的目的是：觀察芳香開(kāi)竅滴鼻劑抗睡眠剝奪的作用效果，探討其作用機(jī)制；評(píng)價(jià)大鼠睡眠剝奪自動(dòng)記錄儀的應(yīng)用情況，以便使其推廣應(yīng)用。 方法：將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、藥物高劑量組、中劑量組、低劑量組，實(shí)驗(yàn)前各組分籠飼養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境1周。自制大鼠滴鼻器，鼻腔給藥。高劑量組每4小時(shí)一次，每次0.3ml·kg-1。中劑量每次0

3、.2ml·kg-1。低劑量每次0.1ml·kg-1。除正常組外，每組動(dòng)物各進(jìn)行72hREMSD。 1睡眠剝奪大鼠模型的建立與復(fù)制：采用小平臺(tái)水環(huán)境法(flowerpotstechnique)復(fù)制該模型。具體操作為：制作40×40×50cm的鼠箱，中間有直徑4.5cm，高10.0cm的平臺(tái)，平臺(tái)周邊注滿(mǎn)水，高約8.0cm，睡眠剝奪自動(dòng)記錄儀探頭由箱底穿入平臺(tái)柱中，距離平臺(tái)頂端2.0cm左右。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行72小時(shí)連續(xù)快動(dòng)眼相睡眠剝奪

4、(rapideyemovmentsleepdeprivation，REMSD)。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物按組分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境6天。 2芳香開(kāi)竅滴鼻劑的制備：石菖蒲及其它藥材(除冰片外)加8倍量水，浸泡1小時(shí)，加沸石5粒，用水蒸氣蒸餾法連續(xù)提取6-8小時(shí)(直至揮發(fā)油不再增多為止)，收集揮發(fā)油，乙酸乙酯萃取，分液收集后揮發(fā)干燥，即得備用揮發(fā)油。冰片1g研成極細(xì)粉，加入液體石蠟研勻，加備用揮發(fā)油1ml，攪拌使之充分溶解后，加液體石蠟至100ml。

5、 3芳香開(kāi)竅滴鼻劑對(duì)睡眠剝奪大鼠行為學(xué)影響的實(shí)驗(yàn)：大鼠落水次數(shù)及每次落入水中的時(shí)間由睡眠剝奪自動(dòng)記錄儀自動(dòng)記錄；其學(xué)習(xí)記憶功能用Y迷宮檢測(cè)；運(yùn)動(dòng)功能通過(guò)走橫木方法評(píng)價(jià)。 4芳香開(kāi)竅滴鼻劑對(duì)睡眠剝奪大鼠腦電圖影響的實(shí)驗(yàn)：用10％水合氯醛4ml/kg腹腔注射大鼠麻醉后，暴露顱骨背側(cè)，在前囟后3.5mm，中線(xiàn)兩側(cè)各3.1mm處，相當(dāng)于海馬位置，植入兩枚直徑0.6mm的螺絲釘作為記錄電極和參考電極，在鼻骨旁植入第三枚電極作為地極

6、，電極深入顱骨下2.5mm。大鼠恢復(fù)一周后，用腦電圖儀，電壓0.5uv，連續(xù)記錄清醒狀態(tài)下各組大鼠的EEG，選用其中有代表性的10秒鐘記錄的波形，對(duì)其中各頻帶進(jìn)行測(cè)量和分析。 5芳香開(kāi)竅滴鼻劑對(duì)睡眠剝奪大鼠血液中生化指標(biāo)影響的實(shí)驗(yàn)：在采用小平臺(tái)水環(huán)境法對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行連續(xù)72hREMSD后，所有動(dòng)物于同一時(shí)間段內(nèi)快速經(jīng)腹主動(dòng)脈抽取血標(biāo)本，分離血清，低溫冰箱(-20℃)保存待測(cè)。放射免疫法檢測(cè)大鼠血清皮質(zhì)醇(Corticostero

7、idCORT)和促腎上腺皮質(zhì)激素(AdrenocorticotrophichormoneACTH)。 6芳香開(kāi)竅滴鼻劑對(duì)睡眠剝奪大鼠海馬NO含量及NOS活性影響的實(shí)驗(yàn)：大鼠REMSD72h后立即予10％水合氯醛腹腔注射麻醉(0.4mg/kg)，開(kāi)胸腹主動(dòng)脈取血后，快速斷頭取腦，分離海馬，分析天平稱(chēng)重，按質(zhì)量加入生理鹽水稀釋至10％，并以玻璃勻漿器勻漿，5400轉(zhuǎn)/分低溫離心10分鐘后沉淀，取上清液，硝酸還原酶法檢測(cè)NO，酶法檢測(cè)

8、NOS。 7芳香開(kāi)竅滴鼻劑對(duì)睡眠剝奪大鼠腦干單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量影響的實(shí)驗(yàn)：大鼠REMSD72h后斷頭，于冰浴下迅速分離出腦干，稱(chēng)重，置玻璃勻漿器中按一定比例(0.05ml/100mg)加入2％三氯醋酸溶液(預(yù)冷至4℃)，溫和勻漿，勻漿液用吸管小心轉(zhuǎn)移入離心管中，用一定比例(0.2ml/100mg)的NaH2P04溶液(0.33mol/L，PH6，內(nèi)含0.5mmol/LNa2EDTA)蕩洗勻漿器，洗液并入離心管，混旋均勻，低溫高速

9、離心(4℃，10000r/min，20min)，取上清液50μl直接進(jìn)樣，用高效液相電化學(xué)法測(cè)定5-HT、DA和NE含量。 實(shí)驗(yàn)中所有的計(jì)量資料均以(-x±s)表示，并使用SPSS10.0forwindows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。 結(jié)果：1芳香開(kāi)竅滴鼻劑高、中、低劑量組均可使睡眠剝奪大鼠每日的落水次數(shù)減少，差異有顯著性意義(P＜0.01)，三劑量組之間每日的落水次數(shù)無(wú)顯著性差別；與模型組比較，中劑量組大鼠的學(xué)習(xí)成績(jī)提高(P＜

10、0.05)；高劑量組的運(yùn)動(dòng)功能得分顯著高于模型組(P＜0.01)。 2睡眠剝奪組與正常組大鼠比較，腦電頻率減慢，波幅減小，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；各給藥組與模型組比較無(wú)顯著性差別，但有頻率加快，波幅增大的趨勢(shì)。 3睡眠剝奪大鼠血液中CORT含量較正常組顯著升高；中、低劑量組ACTH與模型組比較含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 4睡眠剝奪大鼠腦海馬中NO含量與NOS活性較正常組顯著升高，高、

11、中劑量組使其降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；低劑量組與模型組比較無(wú)顯著性差別。 5睡眠剝奪大鼠腦干內(nèi)5-HT含量比正常鼠升高，經(jīng)復(fù)方開(kāi)竅滴鼻劑給藥后，5-HT含量升高；高、中劑量組與模型組比較有顯著性差異，高劑量組最為明顯，低劑量組則差異不明顯。大鼠REMSD72h后腦干內(nèi)DA含量較正常鼠升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)復(fù)方開(kāi)竅滴鼻劑給藥后，DA含量升高；高、中、低劑量組與模型組比較有顯著性差異，高劑量組最為明顯。睡眠剝奪大

12、鼠腦干內(nèi)NE含量較正常鼠降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)復(fù)方開(kāi)竅滴鼻劑給藥后，NE含量升高；高、中劑量組與模型組比較有顯著性差異，高劑量組最為明顯，低劑量組則差異不明顯。 結(jié)論：1芳香開(kāi)竅滴鼻劑可顯著改善大鼠的疲倦程度，使大鼠SD期間落水次數(shù)減少，立于小平臺(tái)上的持久力增強(qiáng)；中劑量的滴鼻劑可顯著提高大鼠的學(xué)習(xí)能力；高劑量滴鼻劑可明顯改善SD大鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性。 2芳香開(kāi)竅滴鼻劑對(duì)SD大鼠每日的腦電圖頻率與波幅均無(wú)顯著性影響，但每日

13、用藥后有腦電頻率增快，波幅加大的明顯趨勢(shì)，提示該藥物可對(duì)SD大鼠產(chǎn)生興奮作用。正常組與模型組腦電差異明顯，其頻率與波幅均高于模型組，說(shuō)明SD本身對(duì)于正常大鼠是一個(gè)抑制的過(guò)程。 3SD的應(yīng)激過(guò)程使大鼠HPAA功能亢進(jìn)，表現(xiàn)為血清中CORT含量升高，但ACTH變化不明顯。而芳香開(kāi)竅滴鼻劑可降低其血清ACTH含量，從而抑制SD應(yīng)激大鼠HPAA的興奮性。 4芳香開(kāi)竅滴鼻劑具有降低睡眠剝奪大鼠海馬NO含量及NOS活性的作用，可減輕