艾灸對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎的防治作用及其機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 艾灸作為中醫(yī)的外治法之一，具有操作簡(jiǎn)便，無(wú)痛苦、療效明顯的優(yōu)點(diǎn)，在臨床上治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)有較好的療效，是極具特色的中醫(yī)治未病療法之一。但是艾灸治療膝OA的作用機(jī)理仍不十分明確，尤其是對(duì)OA的預(yù)防作用研究尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 因此，本課題在現(xiàn)代科學(xué)的方法論指導(dǎo)下，利用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，采用膝關(guān)節(jié)改良伸直位固定法建立兔膝OA模型，運(yùn)用艾灸對(duì)正在進(jìn)行造模的兔施以溫

2、和灸治，在造模8周后，對(duì)軟骨標(biāo)本行組織形態(tài)學(xué)觀察，檢測(cè)關(guān)節(jié)液中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量，測(cè)定軟骨細(xì)胞凋亡率，觀察軟骨細(xì)胞Bcl-2、Bax和P53蛋白表達(dá)，檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨中Bcl-2和Fas的mRNA表達(dá)，從組織、細(xì)胞、分子等不同層面，探討艾灸對(duì)兔膝OA的防治作用和機(jī)理，為臨床艾灸防治OA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 40只日本大耳白兔，隨機(jī)分成4組，每組10只：艾灸組(A

3、組)、幾丁糖組(B組)、模型組(C組)和正常組(D組)。A、B、C組均用改良伸直位固定法建立膝0A模型，A、B組在造模后立即進(jìn)行干預(yù)，A組選取關(guān)元、足三里、血海、內(nèi)外膝眼、陽(yáng)陵泉等腧穴，用艾條溫和灸治，每天1次，每次每穴10mi n；B組用醫(yī)用幾丁糖(20mg/ml)予以膝關(guān)節(jié)注射，0.2ml/次，每周1次；C組不做治療，D組正常飼養(yǎng)，不做任何處理。造模8周后，各組分別從影像學(xué)、肉眼、光鏡下、透射電鏡(TEM)下觀察兔膝關(guān)節(jié)組織形態(tài)學(xué)情

4、況，并用Mankin評(píng)分比較各組膝關(guān)節(jié)軟骨的組織形態(tài)學(xué)改變；用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)各組關(guān)節(jié)液中IL-1β和TNF-α的含量；TdT介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)；免疫組織化學(xué)法(IHC)觀察Bcl-2、Bax、P53蛋白表達(dá)情況；熒光實(shí)時(shí)定量PCR法(Real-Time PCR)檢測(cè)各組關(guān)節(jié)軟骨中Bcl-2和Fas的mRNA表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　

5、1.X片觀察：A、B組關(guān)節(jié)間隙正常，未見(jiàn)骨贅生成，C組可見(jiàn)膝關(guān)節(jié)間隙狹窄，局部有骨贅形成；大體肉眼觀察：A、B組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，無(wú)軟骨缺損，C組關(guān)節(jié)囊明顯增厚，關(guān)節(jié)軟骨呈灰黃色，局部出現(xiàn)潰瘍；光鏡觀察：A組軟骨表面光滑，深層細(xì)胞排列規(guī)律，番紅O染色輕度減弱，潮線完整，C組軟骨產(chǎn)生裂隙，深達(dá)輻射區(qū)，深層細(xì)胞數(shù)目異常，番紅O染色中、重度減弱，潮線模糊；Mankin評(píng)分：A、B組評(píng)分均明顯較C組低(P＜0.01)，A組評(píng)分稍低于B組(P＞0

6、.05)；電鏡觀察：A組軟骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)接近D組，C組軟骨細(xì)胞輪廓不清楚，胞膜壞死崩解，胞漿內(nèi)細(xì)胞器消失，細(xì)胞裂解為致密顆粒樣物質(zhì)，細(xì)胞固縮、變形，甚至出現(xiàn)核分裂，染色質(zhì)濃聚。
　　 2.A、B組IL-1β和TNF-α含量均明顯低于C組(P＜0.01)；A組IL-1β含量和TNF-α含量比B組稍低(P＞0.05)。
　　 3.A、B組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞較少，散在分布于關(guān)節(jié)軟骨淺表區(qū)，C組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞較多，出現(xiàn)在關(guān)節(jié)軟骨中深層。

7、A、B組凋亡指數(shù)明顯低于C組(P＜0.01)；A組凋亡指數(shù)較B組低(P＜0.05)。
　　 4.Bcl-2表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞率：A、B組高于C組(P＜0.05)，A組稍高于B組(P＞0.05)；Bax表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞率：A、B組明顯低于C組(P＜0.05)，A組低于B組(P＜0.05)；Bcl-2/Bax：A組高于B、C、D組(P＜0.05)。
　　 P53表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞率：A、B組明顯低于C組(P＜0.01)，A組比B組稍低(P＞

8、0.05)。
　　 5.Bcl-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量：A、B、C組分別為D組的1.38±0.96倍、1.27±1.15倍、1.08±0.89倍，A、B組和C組Bcl-2的mRNA表達(dá)差別均有非常顯著意義(P＜0.01)，A組和B組差別無(wú)顯著意義(P＞0.05)；Fas mRNA的相對(duì)表達(dá)量，A、B、C組分別為D組的0.27±0.07倍、0.31±1.13倍、2.32±1.35倍，A、B組和C組Fas的mRNA表達(dá)差別均有非常