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文檔簡介
1、背景和目的:
酒精性股骨頭壞死(Osteonecrosis of the femoral head,ONFH)在臨床上常見,早期癥狀隱匿,容易被忽視,當髖部疼痛不適就診時,股骨頭病變往往發(fā)展為ARCOⅡ期或Ⅱ期以上,失去了治療的最佳時期,該病致殘率高,嚴重威脅著人類的健康,迄今沒有發(fā)現(xiàn)有效預防該病發(fā)生的方法。最新的酒精性股骨頭壞死發(fā)病機理動物實驗表明,過氧化物酶體增殖子活化受體-γ(PPARγ)基因在動物股骨頭內的多潛能干
2、細胞骨髓基質細胞(marrow stromal cells,MSCs)成脂分化過程中起著關鍵性的調節(jié)作用,長期大量的酒精攝入可明顯上調PPARγ基因表達,促進MSCs成脂分化,抑制其成骨分化,引起股骨頭內脂肪細胞數目增多、體積增大、脂質沉積、骨細胞變性壞死。本研究運用RNA干擾(RNA interference,RNAi)原理,將經過篩選、鑒定并體外擴增的高效siRNA腺病毒載體注入家兔的股骨頭內,觀察siRNA腺病毒預防酒精性ONFH
3、的效果,從基因方面尋求一種防治酒精性股骨頭壞死的有效途徑。
材料和方法:
選取健康新西蘭種家兔96只,2~3月齡,體重2.7±0.5/只,雌雄不拘,隨機分為4組,每組24只。正常對照組(N組):采用灌胃法,給予10%葡萄糖注射液10ml/(kg·d);酒精組(M組):采用灌胃法,給予白酒(酒精度含量46%V/V)10ml/(kg·d),作為股骨頭壞死模型組;酒精+重組腺病毒組(S組):同法同量灌酒,在實驗第1
4、、3、5月的第1天隨機選擇側別麻醉下經股骨頸行股骨頭穿刺,注入25μl siRNA腺病毒滴液,用骨蠟封閉穿刺小孔。酒精+穿刺組(CO組):手術方法同S組,但不注入siRNA腺病毒載體。各組動物分別于實驗第2、4、6月月末測定空腹血清總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)含量;觀察各組動物股骨頭組織學變化;測定各組股骨頭組織中的最大脂肪細胞平均直徑、骨小梁面積分數和空骨陷窩計數。采用RT-PCR技術檢測各組股骨頭組織中PPARγmRNA和O
5、steocalcin mRNA的表達。Western-blot檢測各組股骨頭內PPARγ蛋白表達。
結果:
1.一般狀況:在整個實驗期間,N組食欲正常,動作敏捷,體重逐漸增加;M、CO兩組隨酒精灌胃時間延長食欲逐漸下降,活動量減小,動作遲緩,體重增長不明顯,精神欠佳,皮毛發(fā)黃、晦澀、失去光澤;S組精神、食欲、體重增長及動作靈活性優(yōu)于M、CO組,但較N組稍差。
2.各組實驗動物各時間段空腹血清甘油
6、三酯(TG)和總膽固醇(CHO)含量變化(mmol/L):實驗第2、4、6個月M、CO、S組動物空腹TG、CHO測定結果明顯高于N組水平,且隨實驗進展呈逐漸增高趨勢,與N組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);股骨頭組織病理學HE染色、蘇丹Ⅲ脂肪染色顯示M、CO組股骨頭內空骨陷窩計數、脂肪細胞及最大脂肪細胞平均直徑明顯增多、增大,骨小梁稀疏、變細,相對N、S組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),S組空骨陷窩計數、脂肪細胞及最大脂肪細胞平均
7、直徑未見明顯增加(P>0.05),相對N組差異無統(tǒng)計學意義。
3.股骨頭骨髓細胞成脂、成骨分化基因檢測結果:RT-PCR檢測股骨頭骨髓細胞中PPARγmRNA和Osteocalcin mRNA基因表達、Western-blot檢測股骨頭骨髓細胞PPARγ蛋白表達結果顯示M、CO組股骨頭內PPARγmRNA基因、PPARγmRNA蛋白相對β-actin的吸光度比值明顯增高,Osteocalcin mRNA基因相對β-acti
8、n的吸光度比值明顯降低,與N、S組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),S組中PPARγmRNA基因、PPARγmRNA蛋白相對β-actin的吸光度比值和Osteocalcin mRNA基因相對β-actin的吸光度比值相對N組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
結論:
1.長期大量的酒精攝入可以導致酒精性股骨頭缺血壞死。
2.pAdeno-X-siPPARγ重組腺病毒能夠有效阻斷PPARγ m
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