瘧疾傳播阻斷疫苗免疫效應(yīng)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文以酵母菌(S．cerevisiae)表達(dá)的傳播阻斷疫苗候選蛋白Pvs25和Pvs28免疫小鼠，并對小鼠免疫后的應(yīng)答特點(diǎn)進(jìn)行了全面系統(tǒng)的研究，以期明確該疫苗的免疫活性。由于嚙齒類瘧原蟲與人類瘧原蟲具有相似的生物學(xué)性狀，所以同時(shí)也用該酵母菌表達(dá)的約氏瘧原蟲(P．yoelii)動合子表面蛋白Pys25對小鼠進(jìn)行免疫，通過對其免疫活性、免疫機(jī)制以及免疫血清傳播阻斷效應(yīng)的觀察，進(jìn)一步證明了傳播阻斷疫苗的效應(yīng)分子和作用機(jī)制。 研究方法：

2、 一、采用ELISA法檢測Pvs25、Pvs28重組蛋白免疫前后DBA2d小鼠血清中特異性IgG的水平尾尖采集初次免疫前和免疫后不同時(shí)間小鼠血液，分離血清。分別以溶于碳酸鹽緩沖液的Pvs25重組蛋白(200ng/孔)，Pvs28重組蛋白(100ng/孔)包被96孔酶標(biāo)板，4℃過夜；用含1％BSA的PBS封閉lh，以TBS緩沖液1：200倍稀釋免疫后不同時(shí)間的小鼠血清，每孔加100μl，室溫孵育2h，加1：5000稀釋的辣根過氧化

3、物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG孵育1h，加底物溶液。酶標(biāo)儀檢測490nm處OD值。 二、采用ELISA法檢測Pvs25、Pvs28重組蛋白免疫DBA/2小鼠前后血清中特異性IgG亞類的水平將1：200倍稀釋后不同時(shí)間段的特異性血清加入預(yù)包被好的96孔培養(yǎng)板中，100μl/孔，室溫孵育2h，分別加入濃度500ng/ml、250ng/ml生物標(biāo)記的大鼠抗小鼠IgG1及IgG2a檢測抗體，100μl/孔，37℃孵育1h；加入親和素37℃孵育1

4、h，加底物，避光30min后終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測450nm處OD值。 三、采用雙抗體夾心ELISA法檢測Pvs25、Pvs28重組蛋白免疫DBA/2dx鼠前后脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子分別于免疫前及初次免疫后第14d、28d、42d、56d、70d、84d、98d和112d，常規(guī)無菌取小鼠的脾臟，制備濃度為1×10<'7>/ml脾細(xì)胞懸液，于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)48h后，收集培養(yǎng)上清，用雙抗體夾心ELISA試劑盒(R&D公司)分別

5、檢測IFN-γ、IL-4和IL-10產(chǎn)生水平。酶標(biāo)儀測定450nm處的OD值。應(yīng)用SoftMax Pro 4.3.1 LS軟件分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算細(xì)胞因子含量(pg/ml)。 四、ELISPOT檢測Pvs25、Pvs28重組蛋白免疫DBA/2小鼠后脾臟IFN-γ<'+>和IL-4<'+>細(xì)胞數(shù)量分別于初次免疫后70d和98d，無菌取小鼠的脾臟，分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，以無血清培養(yǎng)基制備脾淋巴細(xì)胞懸液，采用ELISPOT試

6、劑盒對小鼠脾臟IFN-γ<'+>和IL-4<'+>細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行檢測。主要步驟如下：以IFN-γ以及IL-4包被抗體各50g1分別包被70％乙醇予濕后的96孔PVDF膜平板，4℃過夜；加入封閉液37℃封閉1h后，每孔加入脾細(xì)胞4x10<'5>個(gè)，并分別加入Pvs28或Pvs25重組蛋白，置5％CO<,2>的培養(yǎng)箱中共同孵育24h后棄去細(xì)胞，加入生物素標(biāo)記的IFN-γ或IL-4檢測抗體，37~C孵育1h，加入親和素，37℃孵育1h，顯色液1

7、00gμ/孔，顯色30min，待顯示斑點(diǎn)后，用去離子水洗板終止反應(yīng)， ELISPOT自動分析儀讀板，計(jì)數(shù)IFN-γ<'+>和IL-4<'+>細(xì)胞SFC數(shù)量(斑點(diǎn)形成數(shù)/百萬個(gè)細(xì)胞)。 五、采用ELISA法檢測Pys25重組蛋白免疫DBA/2小鼠前后血清中特異性IgG的水平尾尖采集初次免疫前和免疫后不同時(shí)間小鼠血液，分離血清。以溶于碳酸鹽緩沖液的Pys25重組蛋白200ng/孔包被96孔酶標(biāo)板，每孔100μl，4℃過夜；用含l％B

8、SA的PBS封閉1h，以TBS緩沖液1：200倍稀釋免疫后不同時(shí)間的小鼠血清，每孔加1OO μl，室溫孵育2h，加1：5000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG孵育1h，加底物溶液。酶標(biāo)儀測490nm處OD值。 六、采用雙抗體夾心ELISA法檢測Pys25重組蛋白免疫DBA/2小鼠前后脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子無菌取出于免疫前、初次免疫后第2W和加強(qiáng)免疫后第2W的小鼠脾臟，用含10％FCS的RPMI 1640倍養(yǎng)液常規(guī)制備脾

9、細(xì)胞懸液，調(diào)脾細(xì)胞終濃度至1x10<'7>/ml。于24孔培養(yǎng)板上加入脾細(xì)胞懸液，500 μl/孔，培養(yǎng)48h，收集上清。用雙抗體夾心ELISA試劑盒分別檢測IFN-γ和JL-4產(chǎn)生水平。酶標(biāo)儀測其450nm處OD值，并以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算上清中工FN-γ,UIL-4含量。 七、ELISPoT檢測Pys25重組蛋白免疫DBA/2小鼠后脾臟IFN-γ<'+>和IL-4<'+>細(xì)胞數(shù)量用淋巴細(xì)胞分離液分離加強(qiáng)免疫后

10、第2W小鼠脾淋巴細(xì)胞，以培養(yǎng)液調(diào)淋巴細(xì)胞終濃度至4×10<'6>/ml。用JFN-γ以及IL-4包被抗體分別包被96孔PVDF膜板，4℃過夜。以含BSA的PBS封閉1h，加淋巴細(xì)胞，4x10<'5>個(gè)/孔，每個(gè)樣本設(shè)4個(gè)復(fù)孔。37℃孵育24h。加生物素標(biāo)記的IFN-γ或IL-4檢測抗體，孵育1h，加親和素后再孵育1h。加顯色液顯色30min。ELISPOT自動分析儀讀板，計(jì)數(shù)IFN-γ<'+>和IL-4<'+>細(xì)胞數(shù)量八、動合子培養(yǎng)和傳

11、播阻斷效應(yīng)觀察心臟采集P．yoelii17XL(1x10<'6>PRBC)感染的第3dd,鼠血液(肝素抗凝)，分裝于1.5ml離心管中，200μl/管，離心，去上清。加入含不同濃度免疫血清的動合子培養(yǎng)液，200 μl/管。24℃培養(yǎng)16h后，取3μl懸液滴于熒光載片上，冷丙酮固定。用含5％脫脂奶粉的PBS 37℃封30min。加酶標(biāo)羊抗鼠IgG，孵育30min，熒光顯微鏡觀察計(jì)數(shù)合子和動合子的形成數(shù)量。同時(shí)設(shè)單純佐劑免疫的小鼠血清為對照

12、。 研究結(jié)果： 一、Pvs25、Pvs28重組蛋白免疫DBA/2小鼠前后血清中特異性IgG的水平的變化于初次免疫后第28d，重組蛋白免疫組的工gG水平開始上升。至初次免疫后第112d仍維持于高水平，與免疫前以及佐劑對照組相比差異顯著；而對照組的抗體水平在免疫前后則無明顯變化。 二、Pvs25、Pvs28重組蛋白免疫DBA/2小鼠前后血清中特異性IgG亞類水平的變化重組蛋白組在初次免疫后第28d，小鼠血清中特異性I

13、gG1以及IgG2a均出現(xiàn)有意義的升高，此后IgG1持續(xù)維持在一個(gè)較高的水平，至初次免疫后第112d仍無下降的趨勢；而IgG2a則于初次免疫后第42d出現(xiàn)下降，且此后進(jìn)一步下降；而對照組的抗體亞類水平在免疫前后則無明顯變化。 三、Pvs25、Pvs28重組蛋白免疫DBA/2小鼠前后脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的變化。 1、脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ水平于初次免疫后第14d，小鼠的IFN-γ水平與免疫前相比顯著升高，但此后明顯

14、下降，并于第42d降至免疫前的水平。在第14d佐劑注射組IFN-γ水平也較免疫前出現(xiàn)了一定的升高，但其升高水平顯著低于重組蛋白免疫組。 2、脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4和IL-10水平于初次免疫后第28d，重組蛋白免疫組IL-4水平均出現(xiàn)有意義的升高，于第56d達(dá)到峰值水平后開始下降，但在112d仍高于免疫前水平。IL-10水平亦于初次免疫后第28d出現(xiàn)有意義的升高，于第42d達(dá)到高峰后出現(xiàn)下降，但在112d也仍高于免疫前水平。佐劑

15、組的IL-4、IL-10水平較免疫前無顯著變化。 四、ELISPOT檢測Pvs25，Pvs28重組蛋白免疫DBA/2小鼠后脾臟IFN-γ<'+>和IL-4<'+>細(xì)胞數(shù)量疫苗免疫組小鼠的IFN-γ<'+>細(xì)胞數(shù)量較對照組無明顯差異。而IL-4<'+>細(xì)胞數(shù)量卻顯著增加，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的IFN-γ<'+>以及IL-4<'+>細(xì)胞數(shù)分別與各自組比較無明顯差異。佐劑組的IL-4<'+>水平較免疫前無顯著變化。 五、Pys25重組蛋

16、白免疫DBA/2小鼠前后血清中特異性IgG的水平變化初次免疫后2W，小鼠血清中IgG出現(xiàn)升高，并于加強(qiáng)免疫后2～3W達(dá)到峰值水平。此后開始緩慢下降，但其在20W的水平也明顯高于加強(qiáng)免疫前的水平。 六、Pys25重組蛋白免疫DBA/2小鼠后不同時(shí)間檢測點(diǎn)上的細(xì)胞因子水平與免疫前相比，初次免疫后2W，小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4均出現(xiàn)了有意義的升高，但前者的升高水平更為顯著；再次免疫后僅見IL-4出現(xiàn)了進(jìn)一步的升高，而I

17、FN-γ已降至初次免疫前的水平。 七、Pys25重組蛋白加強(qiáng)免疫DBA/2小鼠后脾細(xì)胞中IFN-γ<'+>和IL-4<'+>細(xì)胞數(shù)量與免疫前相比，加強(qiáng)免疫后2W，小鼠脾細(xì)胞中IL-4<'+>細(xì)胞的數(shù)量出現(xiàn)了顯著的升高，但I(xiàn)FN-γ<'+>細(xì)胞的數(shù)量未出現(xiàn)有意義的變化。 研究結(jié)論： 1、Pvs25、Pvs28重組蛋白具有較好的免疫活性，免疫DBA/2小鼠后可產(chǎn)生高水平的抗體； 2、Pvs25、Pvs28免疫

18、DBA/2小鼠后產(chǎn)生以的抗體亞類以IgG1為主； 3、Pvs25、Pvs28重組蛋白可誘導(dǎo)DBA/2小鼠產(chǎn)生以Th2反應(yīng)為主的免疫應(yīng)答； 4、Pvs25、Pvs28重組蛋白免疫DBA/2后可誘導(dǎo)較強(qiáng)的特異性免疫應(yīng)答，并具有顯著的免疫記憶性； 5、Pys25重組蛋白免疫DBA/2小鼠后誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答類型以Th2反應(yīng)為主； 6、Pys25重組蛋白具有良好的免疫原性，其免疫血清可顯著抑制有性階段原蟲的進(jìn)