豬miR-155兩種基因型的性狀關(guān)聯(lián)分析的研究.pdf

1、微小RNA(microRNA)是非編碼RNA中最為人們熟悉的一個(gè)亞類，它廣泛的參與發(fā)育，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增值。miR-155在免疫系統(tǒng)發(fā)生發(fā)育及調(diào)控中扮演重要角色，其宿主基因上關(guān)鍵位點(diǎn)的突變可能導(dǎo)致miR-155表達(dá)量的改變，從而引起下游免疫系統(tǒng)的差異。我們根據(jù)miR-155宿主基因BIC(B-cellIntegration Cluster)上的SNP信息，利用PCR-RFLP方法在中外培育品種豬中鑒定了兩種基因型個(gè)體，利用流式細(xì)胞術(shù)分選

2、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell，Treg)以進(jìn)行后續(xù)基因表達(dá)差異試驗(yàn)驗(yàn)證，同時(shí)統(tǒng)計(jì)分析了其中一個(gè)關(guān)鍵SNP的基因型與杜洛克×二花臉F2資源群體的免疫指標(biāo)關(guān)聯(lián)性，具體結(jié)果如下:
　　(1)不同豬種兩種基因型個(gè)體的鑒定在miR-155宿主基因BIC上，我們將miR-155前體的第一個(gè)堿基以+1表示，上游305bp的A/C突變以-305bp表示，我們根據(jù)-305A/C這個(gè)SNP信息，在三個(gè)中外培育品種中尋找兩種基因型個(gè)

3、體。通過(guò)對(duì)55頭蘇鐘豬、300鄂通兩頭烏和250頭湖北白豬進(jìn)行PCR-RFLP分析，在鄂通兩頭烏中挑選得到4頭AA型個(gè)體和3頭CC型個(gè)體，在湖北白豬中挑選到2頭AA型.個(gè)體和2頭CC型個(gè)體。在鄂通兩頭烏群體中，AA基因型頻率為0.0348，AC基因型頻率為0.4609，CC基因型頻率為0.5043。A的基因頻率為0.2653，C的基因頻率為0.7347。在湖北白豬群體中，AA基因型頻率為0.8279，AC基因型頻率為0.1680，CC基

4、因型頻率為0.0041。A的基因頻率為0.9119，C的基因頻率為0.0881。在檢測(cè)的55頭蘇鐘豬中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CC型。AA基因型頻率為0.6545，AC基因型頻率為0.3455。A的基因頻率為0.8273，C的基因頻率為0.1727。
　　(2)兩種基因型豬血常規(guī)性狀差異分析利用Beckman Coulter Ac.Tdiff2血細(xì)胞分析儀對(duì)兩種基因型的鄂通兩頭烏進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，將4頭AA基因型個(gè)體和3頭CC基因型個(gè)體的血液指標(biāo)

5、進(jìn)行T檢驗(yàn)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn):兩種基因型豬間，紅細(xì)胞平均體量（MCV，fL）存在差異(P＜0.05)，紅細(xì)胞體積分布寬度(RDW，％)存在顯著差異(P＜0.01)。
　　(3)MiR-155上游305A/C突變與F2群體一些免疫指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析根據(jù)miR-155上游305bp的A/C突變對(duì)杜洛克×二花臉F2資源群體共計(jì)394頭個(gè)體進(jìn)行分型，并在不同時(shí)間點(diǎn)與該群體的免疫指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明:在F2群體中，AA基因型頻率為0.2507

6、，AC基因型頻率為0.5171，CC基因型頻率為0.2321。A的基因頻率為0.5092，C的基因頻率為0.4908。在20日齡時(shí)，miR-155前體上游305A/C突變對(duì)CD4-CD8+CD3-，CD4-CD8+CD3+細(xì)胞有顯著影響(P＜0.05)。在33日齡時(shí)，miR-155前體上游305A/C變異對(duì)紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、紅細(xì)胞比容(HCT)和血紅蛋白含量(HGB)有顯著影響(p＜0.05)，對(duì)血小板體積分布寬度(PDW)和血小板平

7、均體積(MPV)有極顯著影響(p＜0.01)。在35日齡時(shí)，該SNP對(duì)血紅蛋白含量(HGB)、紅細(xì)胞比容(HCT)有顯著影響(p＜0.05)，對(duì)血小板體積分布寬度(PDW)有極顯著影響(p＜0.01)。在80日齡時(shí)，對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)(EO)，嗜酸性粒細(xì)胞比率(EOP)有顯著影響(p＜0.05)。該位點(diǎn)可能影響miR-155的表達(dá)，從而在個(gè)體生長(zhǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)，調(diào)控不同的通路，影響不同類型的免疫細(xì)胞的發(fā)育。
　　(4)兩種基因型豬的T

8、reg細(xì)胞分選利用流式細(xì)胞儀和三種不同熒光標(biāo)記的抗體分選不同基因型豬的Treg。先根據(jù)總白細(xì)胞中不同細(xì)胞的物理參數(shù)（大小，濃度等）的不同分選出淋巴細(xì)胞，設(shè)置一個(gè)門，再?gòu)倪@個(gè)門中分選出CD3+的細(xì)胞類群，再?gòu)闹羞x取CD4+細(xì)胞，最后再?gòu)腃D4+T細(xì)胞中選擇CD25+細(xì)胞，最終得到Treg細(xì)胞，流式細(xì)胞分析結(jié)果表明豬Treg細(xì)胞占總白細(xì)胞的1％左右。
　　(5)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-155對(duì)其靶基因的作用通過(guò)轉(zhuǎn)染mimic155到豬的巨