11579.紅球菌p14烷烴降解特性及降解相關(guān)基因的研究

1、汕頭大學(xué)碩士學(xué)位論文碩士學(xué)位論文題目紅球菌P14烷烴降解特性及降解相關(guān)基因的研究英文題目StudyonalkanedegradationdegradationrelatedgenesofRhodococcussp.P14姓名喬璟學(xué)號11108068所在學(xué)院理學(xué)院導(dǎo)師姓名胡忠教授專業(yè)生物化學(xué)與分子生物學(xué)入學(xué)日期2011年9月答辯日期2014年6月汕頭大學(xué)碩士學(xué)位論文I摘要石油不僅是支撐現(xiàn)代工業(yè)的主要能源，同時也是主要的環(huán)境污染源，海洋環(huán)境

2、中的石油泄露事故造成環(huán)境的嚴(yán)重污染。烷烴是石油的主要組成成分，細(xì)菌在石油污染物的生物降解中扮演重要作用，目前已經(jīng)分離到一些能夠降解石油烴類物質(zhì)的海洋細(xì)菌。紅球菌P14是本實(shí)驗(yàn)室前期從近海沉積物中分離到的一株能夠利用烷烴、多環(huán)芳烴等污染物的革蘭氏陽性細(xì)菌。通過基因組測序分析，發(fā)現(xiàn)紅球菌P14中存在多個烷烴降解有關(guān)的基因簇。本論文通過GC分析測定紅球菌P14對不同鏈長的烷烴底物的利用能力，進(jìn)一步對相關(guān)烷烴降解基因功能進(jìn)行研究。主要結(jié)果如下：

3、菌株P(guān)14可以利用多種烷烴作為唯一碳源生長。菌株P(guān)14在以終濃度為0.1%的液體烷烴C11、C16為唯一碳源、25℃培養(yǎng)8d后，對C11、C16的降解率分別為51.95%、89.10%；在以終濃度為100mgL的C20、C24、C28、C32的固體烷烴為唯一碳源、25℃培養(yǎng)32d后，對C20、C24、C28、C32的降解率分別為72.89%、82.66%、55.79%、78.85%、49.51%。菌株P(guān)14對C16的降解率最高，同時也能

4、夠有效地降解支鏈烷烴C19H40，培養(yǎng)18d后，菌株P(guān)14對C19H40降解率為81.47%。為了進(jìn)一步研究紅球菌P14的烷烴降解機(jī)制，從菌株P(guān)14基因組中擴(kuò)增到3個編碼烷烴羥化酶的基因：膜結(jié)合的烷烴羥化酶基因alkB1alkB3，細(xì)胞色素P450單加氧酶基因p4502251。通過利用共表達(dá)質(zhì)粒pACYCDuet1、pETDuet1，將alkB1及編碼電子傳遞蛋白、紅素氧還蛋白RubA1、RubA2、紅素氧還蛋白還原酶RubR的基因在大

5、腸桿菌中異源表達(dá)，同時將alkB3基因克隆至alkB1所在酶系中，驗(yàn)證其功能。重組表達(dá)產(chǎn)物AlkB1酶系對中鏈烷烴C16的降解率為61.99%，對較長鏈烷烴C20、C24的降解率分別為29.27%、24.58%，而重組表達(dá)產(chǎn)物AlkB3酶系則沒有檢測到相應(yīng)的烷烴降解活性。通過對細(xì)胞色素P450基因2251的RTqPCR分析，發(fā)現(xiàn)p4502251基因在中長鏈烷烴底物C8、C11、C16誘導(dǎo)下，轉(zhuǎn)錄水平的基因表達(dá)量上調(diào)，且在C11誘導(dǎo)下基因

6、表達(dá)量最高，而在較長鏈烷烴C20誘導(dǎo)下，轉(zhuǎn)錄水平的基因表達(dá)量并無變化，推測p4502251基因可能參與C8、C11、C16等中長鏈烷烴的降解。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：p4502251基因上下游有P450單加氧酶催化反應(yīng)所需的鐵氧還蛋白Fdx（2250基因編碼）、鐵氧還蛋白還原酶FdxR（2252基因編碼），將p4502251基因所在酶系在大腸桿菌異源表達(dá)，分析發(fā)現(xiàn)重組菌表達(dá)產(chǎn)物只對C8有一定的降解，對其他烷烴底物均未無降解。推測基因p450