15365.假海源菌zjcn121基因組文庫的構(gòu)建及巖藻多糖酶基因的篩選

1、I摘要巖藻多糖酶能水解巖藻多糖生成低分子量的巖藻多糖，低分子量的巖藻多糖具有溶解性大、吸收好、抗腫瘤、增強機體免疫等多種生理功能，在醫(yī)療和保健方面具有廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景。用巖藻多糖酶制備低分子量巖藻多糖，過程安全，反應(yīng)條件溫和，對設(shè)備要求不高；專一性強，產(chǎn)物較純凈，便于分離提純精制；對原料要求不高。但從自然環(huán)境中獲得天然巖藻多糖酶較難，工藝復(fù)雜，因此研究巖藻多糖酶基因，從基因水平來調(diào)控表達巖藻多糖酶就具有深遠的意義。本文以海洋細菌ZJ

2、CN121為材料，按照分子生物學技術(shù)構(gòu)建其基因組文庫。采用SDSPAGE蛋白質(zhì)電泳初步估計ZJCN121菌株產(chǎn)巖藻多糖酶的分子量。采用CTABNaCl法提取ZJCN121菌株的基因組DNA，用1.5LHindⅢ于37℃部分酶切7L基因組DNA2min，用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收純化38kb的酶切DNA片段，然后與載體pET32a連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。隨機挑選轉(zhuǎn)化子進行穩(wěn)定性鑒定和插入片段大小分析。結(jié)果表明

3、外源插入片段平均大小為6kb左右，轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定，獲得約2000個轉(zhuǎn)化子。在構(gòu)建的ZJCN121菌株基因組文庫的基礎(chǔ)上，用含3%巖藻多糖的Zobell2216E培養(yǎng)基篩選含巖藻多糖酶基因的陽性克隆子。用1%剛果紅染色和1mmolLNaCl洗脫，觀察透明圈篩選陽性克隆子，測酶活復(fù)篩最終篩選獲得一株陽性克隆子。經(jīng)過酶切和SDSPAGE蛋白質(zhì)電泳鑒定，發(fā)現(xiàn)該陽性克隆子質(zhì)粒有插入片段，并獲得約60kDa的蛋白條帶，說明該陽性克隆子含有目的基因通