16027.假海源菌zjcn121巖藻多糖酶的制備、純化和性質(zhì)研究

1、摘要巖藻多糖酶是一種多糖水解酶。因利用酶解法制備低分子量巖藻多糖（LMWF），具有底物專一性強、催化效率高、反應(yīng)條件溫和、污染少、易于提取和純化等優(yōu)點，所以已逐漸取代化學法而成為生產(chǎn)LMWF的主要方法。另外，由于該酶在研究巖藻多糖的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)與功能機制之間的關(guān)系上也有著非常重要的作用，因此，學者們對巖藻多糖酶的研究十分感興趣。為了提高一株海洋細菌ZJCN121的產(chǎn)酶能力，本研究通過單因素實驗，PlackettBurman設(shè)計實驗和響應(yīng)面

2、實驗相結(jié)合的方法對巖藻多糖酶液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基成分進行了優(yōu)化。結(jié)果得出影響菌體產(chǎn)酶能力的主要因素為麩皮、氯化鈉和巖藻多糖，進而采用中心組合設(shè)計和響應(yīng)面分析確定出主要因素的最佳濃度。最終獲得最優(yōu)培養(yǎng)基組成為（gL）：麩皮2.73、氯化鈉31.04、巖藻多糖0.54、葡萄糖0.455、硝酸鈉2、硫酸鎂3、氯化鈣0.04、磷酸氫二鈉0.7。同時用單因素實驗對發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。結(jié)果得出菌體在初始pH為6.5、接種菌齡為12h、接種量為3%，于20

3、℃培養(yǎng)16h時，巖藻多糖酶活力可達到1.43IUmL，比優(yōu)化前提高了2.07倍，并從該菌的產(chǎn)酶歷程中確定其合成巖藻多糖酶為同步合成型。在最優(yōu)條件下液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)假海源菌ZJCN121，用緩沖液提取巖藻多糖酶。過濾和離心得到粗酶液，粗酶液通過丙酮沉淀和SephadexG100層析柱純化后，經(jīng)PAGE電泳、SDSPAGE電泳、EIFPAGE電泳后，均顯示為一條帶，證明其成分單一，達到純化目的。其純化倍數(shù)為21.8，回收率為13.5%，并測得該

4、酶的相對分子量為60.2kDa。等電點為4.3。純酶部分性質(zhì)研究結(jié)果表明：巖藻多糖酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，半失活溫度為62℃；最適反應(yīng)pH為6.6，穩(wěn)定區(qū)間為6.27.0，在此區(qū)間內(nèi)的酶有較高活性。在濃度為1mmolL的金屬離子存在時，Ca2和Ba2對酶略有激活作用，F(xiàn)e2、Cu2則強烈抑制酶活，Mn2、K、Zn2也在一定程度上抑制酶活性，Mg2對酶的作用效果不明顯，其催化底物Fucusvesiculosus巖藻多糖的Km為5.87m