14646.串聯(lián)質(zhì)譜從頭測序技術(shù)體系的建立、應(yīng)用及無指盤臭蛙皮膚先天免疫的時(shí)空動(dòng)態(tài)

1、By【Liu，Jiongyu】ADissertation／ThesisSubmittedtoTheUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfdlmentoftherequirementForthedegreeofDoctorof【Science】[ChengduInstituteofBiology，ChineseAcademyofSciences】May，2013摘要摘要普遍認(rèn)為兩

2、棲動(dòng)物皮膚功能基因組具有多態(tài)性豐富、隨環(huán)境變化而快速重組突變的特征，造成這種分子多態(tài)性和復(fù)雜性的顯著差異的因素，最合理的解釋就是環(huán)境，尤其是環(huán)境微生物的驅(qū)動(dòng)，然而此理論還缺乏足夠的研究證據(jù)。已有研究表明，不同產(chǎn)地或不同時(shí)間點(diǎn)的無指盤臭蛙皮膚抗菌肽種類和數(shù)量多變，而抗菌肽為兩棲動(dòng)物先天免疫系統(tǒng)的主要成分，也是皮膚分泌物中的主要多肽。因此，研究無指盤臭蛙皮膚的先天免疫(首先是分泌物，然后是抗菌肽)的動(dòng)態(tài)變化及與環(huán)境因子，特別是環(huán)境細(xì)菌的關(guān)系

3、，有可能解決兩棲動(dòng)物皮膚功能基因組受環(huán)境，尤其環(huán)境細(xì)菌驅(qū)動(dòng)的問題。本論文首先以景東臭蛙為對(duì)象，分離純化皮膚抗菌肽并鑒定一級(jí)結(jié)構(gòu)，從而建立以串聯(lián)質(zhì)譜從頭測序技術(shù)為核心的兩棲動(dòng)物皮膚分泌活性多肽的研究技術(shù)體系，克服兩棲動(dòng)物皮膚功能基因組受環(huán)境驅(qū)動(dòng)問題的研究在抗菌肽層次的主要技術(shù)瓶頸；然后以無指盤臭蛙為研究對(duì)象，從分泌物的層次研究了不同地點(diǎn)或同一地點(diǎn)不同時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)物先天免疫的動(dòng)態(tài)變化；最后利用建立的技術(shù)體系進(jìn)行了無指盤臭蛙皮膚分泌物中動(dòng)態(tài)變化

4、抗菌肽的初步研究。(A)景東臭蛙皮膚抗菌肽的分離純化、鑒定及活性研究以景東臭蛙為對(duì)象，分離純化皮膚抗菌肽、鑒定序列并驗(yàn)證活性，研究結(jié)果：1發(fā)現(xiàn)了8個(gè)抗菌肽，其中兩對(duì)具有相同的理論分子量且難于被HPLC分離。2Brevinin1JDa和Nigrocin2JDa為首次在天然蛋白水平被確認(rèn)，Brevinin1JDc為新肽，且二硫環(huán)內(nèi)序列CLISKKC為首次在抗菌肽中被發(fā)現(xiàn)。3在4個(gè)抗菌肽的二級(jí)質(zhì)譜中觀察到了罕見的低能量、陽離子模式下的分子內(nèi)二

5、硫環(huán)內(nèi)斷裂現(xiàn)象，且首次闡明了其完整裂解途徑為：C端肽鍵按照環(huán)肽斷裂模式依次斷裂，然后在C—S鍵上發(fā)生次級(jí)剪切，此類斷裂的標(biāo)志離子為[MH一28】；此發(fā)現(xiàn)說明二硫環(huán)內(nèi)斷裂現(xiàn)象在含C端二硫環(huán)的肽中可能并不罕見，此機(jī)理的提出為Topdown測序直接鑒別二硫環(huán)內(nèi)序列提供了可能，也能被用于二硫鍵定位。4殺菌動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果揭示了發(fā)現(xiàn)的部分抗菌肽，其作用機(jī)理可能不同于經(jīng)典的膜破壞機(jī)理。(B)串聯(lián)質(zhì)譜從頭測序技術(shù)體系的組成與關(guān)鍵點(diǎn)通過以上實(shí)踐研究，建立