毛白楊雄株花粉敗育細(xì)胞學(xué)觀察和雙抗蟲基因轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、通過基因工程培育抗蟲且對(duì)環(huán)境安全的楊樹新品種,已經(jīng)成為楊樹抗蟲基因工程研究的主要方面.為避免雌株飛絮,雄株花粉漂移攜帶外源基因轉(zhuǎn)移等環(huán)境問題,該研究確定了以毛白楊敗育雄株為雙價(jià)抗蟲基因遺傳轉(zhuǎn)化工程體.在對(duì)其進(jìn)行花粉敗育形態(tài)學(xué)和細(xì)胞組織學(xué)研究基礎(chǔ)上,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)其進(jìn)行雙抗蟲基因(Bt基因和API基因)的轉(zhuǎn)化,并對(duì)篩選獲得的卡那霉素抗性植株進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)和抗蟲性鑒定.主要研究結(jié)果如下:1)毛白楊雄株花藥外部形態(tài)及花粉發(fā)育過程連續(xù)兩

2、年實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明:從花藥發(fā)育的外部形態(tài)觀察,在花藥發(fā)育的過程中沒有觀察到散粉現(xiàn)象;從花粉發(fā)育的細(xì)胞組織學(xué)觀察,其花粉敗育的原因可能是絨氈層細(xì)胞解體延遲導(dǎo)致小孢子發(fā)育受阻,不能形成正常成熟的花粉粒.由此確定該毛白楊雄株為雄性不育.2)建立了毛白楊雄株遺傳轉(zhuǎn)化再生體系.確定其轉(zhuǎn)化時(shí)所用的誘導(dǎo)芽分化培養(yǎng)基為:MS+TDZ0.1mg/L+IAA0.1mg/L附加蔗糖3％、瓊脂0.6%;轉(zhuǎn)化芽增殖培養(yǎng)基為:MS+6-BA0.3mg/L+IBA0.1

3、mg/L附加蔗糖3%、瓊脂0.6%;生根培養(yǎng)基為:1/2MS+IBA0.5mg/L附加蔗糖1.5%、瓊脂0.6%.3)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)258個(gè)葉片外植體進(jìn)行雙抗蟲基因的轉(zhuǎn)化,其中分化數(shù)為81個(gè),共得到108個(gè)轉(zhuǎn)化芽.將所得的轉(zhuǎn)化芽經(jīng)卡那霉素抗性篩選,共得到21株卡那抗性植株,將部分卡那抗性苗經(jīng)PCR檢測(cè),陽性率為90%,3株陽性植株經(jīng)Southern雜交分析,證明外源Bt基因已整合到楊樹基因組DNA中.4)用轉(zhuǎn)基因毛白楊雄株的幼嫩葉片

4、喂養(yǎng)楊扇舟蛾和舞毒蛾幼蟲,蟲試結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因毛白楊雄株對(duì)幼蟲的毒性明顯大于對(duì)照未轉(zhuǎn)基因植株.根據(jù)昆蟲的總死亡率將轉(zhuǎn)基因植株劃分為高抗、中抗、低抗、不抗四個(gè)等級(jí),篩選出4個(gè)高抗無性系(D-84、D-87、D-94、D-95)、3個(gè)中抗無性系(D-74、D-85、D-88).對(duì)測(cè)試?yán)ハx的生長(zhǎng)、發(fā)育進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明:各轉(zhuǎn)基因無性系對(duì)測(cè)試?yán)ハx的生長(zhǎng)發(fā)育有明顯抑制作用,轉(zhuǎn)基因無性系中昆蟲各發(fā)育齡期比對(duì)照明顯延長(zhǎng),昆蟲體重增長(zhǎng)速率比對(duì)照明顯減慢