19146.基于goldengate技術(shù)的載體構(gòu)建新方法

1、ThenovelmethodsofvectorconstructionbasedonGoldenGatecloningtechnologyByPuYanADissertationSubmittedtoGraduateUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmentoftherequirementForthedegreeofDoctorofScienceSouthChinaB

2、otanicalGarden，ChineseAcademyofSciencesMay2012摘要摘要載體構(gòu)建是分子生物學(xué)研究中的基礎(chǔ)和重要環(huán)節(jié)。在各種載體構(gòu)建的方法中，GoldenGate技術(shù)是一種新近發(fā)展的快速克隆技術(shù)，它利用IIS類型的限制性內(nèi)切酶在識別位點(diǎn)外切割的特點(diǎn)，使酶切和連接能在一管內(nèi)同步完成，并且能同時連接多個DNA片段?；贕oldenGate技術(shù)，本論文創(chuàng)建了一種用于質(zhì)粒載體改造和構(gòu)建的新方法，同時還對2類特定載體一植

3、物RNA干擾(RNAi)載體和植物雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)載體的構(gòu)建方法和策略進(jìn)行了改進(jìn)和創(chuàng)新。主要研究結(jié)果如卜：1建立了一種用于質(zhì)粒載體改造和構(gòu)建的新方法本研究基于GoldenGate克隆技術(shù)，建立了t0快速和高效地進(jìn)行載體改造和構(gòu)建的新方法。該方法通過在DNA片段兩端加帶IIS類型的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)并設(shè)計(jì)其酶切后產(chǎn)生的4bp粘性末端序列(接頭)，能通過一步酶切一連接反應(yīng)同時把多個DNA片段或遺傳模塊拼接成環(huán)狀質(zhì)粒，完成載體構(gòu)建；同

4、時在拼接處可進(jìn)行點(diǎn)突變、長片段缺失和插入等各類型的載體改造。使用該方法，成功進(jìn)行了載體的改造，包括其它方法難以達(dá)到的復(fù)雜類型的載體改造，即同時在質(zhì)粒的3個位點(diǎn)處進(jìn)行堿基替換、酶切位點(diǎn)插入以及長片段缺失和插入。并且，使用該方法進(jìn)行多個DNA遺傳元件或模塊的拼接，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體和植物表達(dá)載體。該方法簡單、快速、高效，且成本低，無需特殊試劑，有望在載體改造和構(gòu)建上得到廣泛應(yīng)用。2創(chuàng)建了一種快速構(gòu)建植物ihpRNA表達(dá)載體的新方法隨著R

5、NA干擾(RNAi)技術(shù)在植物基因功能分析上的廣泛應(yīng)用，需要一種能高通量構(gòu)建植物發(fā)夾RNA(hpRNA)表達(dá)載體的方法。本研究基于GoldenGate克隆技術(shù)，創(chuàng)建了t0構(gòu)建含內(nèi)含子發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(ihpRNA)表達(dá)載體的新方法。在此方法中，首先構(gòu)建了一個與GoldenGate克隆系統(tǒng)配套的植物RNAi載體(命名為pRNAiGG)，用于ihpRNA表達(dá)載體的構(gòu)建。pRNAi—GG含有一個2X35S啟動子8saI位點(diǎn)eedB基因8saI位

6、點(diǎn)PDK內(nèi)含子一gsaI位點(diǎn)ccdB基岡BsaI位點(diǎn)Nos終止子的表達(dá)框結(jié)構(gòu)。使用該方法，只需在擴(kuò)增靶基因序列的同時，由引物在序列兩端加上相應(yīng)的BsaI識別和切割位點(diǎn)，經(jīng)一步酶切一連接反應(yīng)后，此靶基因片段能同時以正向和反向的位置克隆到pRNAiGG，形成ihpRNA表達(dá)載體結(jié)構(gòu)。整個構(gòu)建過程只需在一管中通過一個反應(yīng)完成，且構(gòu)建效率高，無背景干擾，同時由于pRNAiGG為植物雙元表達(dá)載體，構(gòu)建好的ihpRNA表達(dá)載體可直接用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化研