27615.嗜熱厭氧乙醇桿菌體外轉錄系統(tǒng)的構建及應用

1、學位論文獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：1、堅持以“求實、創(chuàng)新一的科學精神從事研究工作。2、本論文是我個人在導師指導下進行的研究工作和取得的研究成果。3、本論文中除引文外，所有實驗、數(shù)據(jù)和有關材料均是真實的。4、本論文中除引文和致謝的內容外，不包含其他人或其它機構已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。5、其他同志對本研究所做的貢獻均已在論文中作了聲明并表示了謝意。研究生簽名：數(shù)Et期：叢絲：』：么幺學位論文使用授權聲明本人完全了解南京師范大學有關保留、使

2、用學位論文的規(guī)定，學校有權保留學位論文并向國家主管部門或其指定機構送交論文的電子版和紙質版；有權將學位論文用于非贏利目的的少量復制并允許論文進入學校圖書館被查閱；有權將學位論文的內容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索；有權將學位論文的標題和摘要匯編出版。保密的學位論文在解密后適用本規(guī)定。研究生簽名：望磊左，日期：塑絲：』：[正摘要摘要嗜熱厭氧乙醇桿菌(Thermoanaerobacterethanolicus)作為嗜熱菌中乙醇產量較高的菌種，它具有

3、高生長溫度，較好的耐酸性以及完整的纖維素和半纖維素代謝系統(tǒng)，這些優(yōu)點使其成為乙醇生產茵改造的熱點。轉錄系統(tǒng)因背景干擾低，反應組分明確，結果清晰準確成為研究菌體轉錄情況的有力工具。本研究構建Zethanolicus的體外轉錄系統(tǒng)，并運用該系統(tǒng)對ZethanolicusJW200中的未知蛋白Tethll的功能進行研究。。體外轉錄系統(tǒng)的構建關鍵是獲得RNA聚合酶。這方面的研究主要是通過異源菌表達體外重組RNA聚合酶以及提取天然菌的RNA聚合酶

4、兩個方面來進行的。體外重組中，首先分別構建含有伐、p、p’、∞和。亞基的表達載體pETalphaHis、pETbetaHis、pETbetaHis、pETomega以及pETsigmaHis，在大腸桿菌中異源表達并純化獲取純的亞基。其中將僅、p、p’和∞按照22：1：1：1的比例進行體外重組RNA聚合酶核心酶，并通過Histag親和層析技術獲得了純化的核心酶。天然酶的純化是利用聚乙醇胺粗沉淀與NaCl抽提、硫銨沉淀、肝素親和層析以：及D

5、EAE陰離子交換層析技術經(jīng)過4步純化獲得了純度為95％天然RNA聚合酶核心酶。另外我們根據(jù)ZethanolicusJW200中的adhB基因及其側翼序列并以pHsh質粒為模體，構建了轉錄所用的模板質粒pHshtmpl。在69。C下，以該質粒為模板分別用重組RNA聚合和天然RNA聚合酶進行轉錄，使用地高辛染色檢測轉錄產物，重組RNA聚合酶沒有檢測到酶活而天然RNA聚合酶轉錄出預計大小的條帶。TethlI作為一個背景完全未知的蛋白，我們采取

6、生物信息學預測蛋白結構，電泳遷移率變動分析和體外轉錄實驗對其結構和功能進行研究。首先根據(jù)該蛋白N段氨基酸序列的測序結果，我們將該蛋白的基因克隆到pET28a()中。測序結果表明該蛋白有297bp，編碼98個氨基酸，理論分子量為11kD。NCBI比對結果顯示該蛋白一級結構上具有兩個保守區(qū)域，一個在811個氨基酸之間，j另一個位于第43個氨基酸和第83個氨基酸之間，在三級結構上該蛋白具有螺旋轉角螺旋的DNA結合模體。通過電泳遷移率變動實驗驗