黃熱厭氧芽孢桿菌云南亞種三種新型糖苷酶的鑒定及性質(zhì)研究.pdf

1、嗜熱微生物是一種生活在高溫環(huán)境中的微生物，在探討生物進(jìn)化、高溫適應(yīng)機(jī)制和嗜熱酶資源的挖掘方面都具有重要的意義。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，很多嗜熱微生物的全基因組被測(cè)序，這為挖掘新型酶資源提供了很好的資源。黃熱厭氧芽孢桿菌(Anoxybacillus flavithermus subsp.yunnanensis)E13T最適生長(zhǎng)溫度為55℃，2014年其基因組測(cè)序完成。本文對(duì)該菌株的糖苷酶進(jìn)行了分析，篩選出三個(gè)未被報(bào)道且與已知同源性酶相似

2、性較低（不超過(guò)60％）的糖苷水解酶進(jìn)行克隆表達(dá)和酶學(xué)研究。這三個(gè)酶為β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.1.21，BglP）、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，EC.3.2.1.23，BgalP)和α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，EC3.2.1.22,AgalP)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴β-葡萄糖苷酶BglP克隆在表達(dá)載體pET22b上，在大腸桿菌中獲得了可溶性表達(dá)，純化后的

3、蛋白分子量為52 kDa，與理論分子量一致。酶學(xué)性質(zhì)結(jié)果顯示，BglP的最適溫度為60℃，最適pH為7.0。BglP的熱穩(wěn)定性很好，60℃的半衰期長(zhǎng)達(dá)10h。它在中性和弱堿環(huán)境(pH7.0-8.5)中也非常穩(wěn)定。BglP在以對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)為底物時(shí)的比活為842±15.5 U/mg，Km為0.29±0.01 mM，Vmax為771±39μmol/min.mg。以纖維二糖為底物時(shí)，BglP的Km和Vmax分別為

4、12.3±0.8 mM和107±5.6μmol/min.mg，這表明BglP是一個(gè)催化效率很高的酶。值得注意的是，BglP是一個(gè)比較少見(jiàn)的葡萄糖和木糖激活酶。當(dāng)葡萄糖和木糖的濃度分別高于2.2 M和1.4 M時(shí)，BglP的活力才出現(xiàn)抑制效應(yīng)，而在這個(gè)濃度以內(nèi)，BglP的活力被顯著的提高，最高時(shí)分別為無(wú)添加時(shí)的2.6倍（葡萄糖激活）和1.8倍（木糖激活）。葡萄糖不僅能提高BglP的酶活，還能顯著提高BglP的溫度穩(wěn)定性。這些性質(zhì)綜合表明B

5、glP是一個(gè)具有優(yōu)良潛力的新型β-葡萄糖苷酶。BglP在最優(yōu)條件下對(duì)大豆苷水解率為98.5％，對(duì)染料木苷水解率為96.8％，展示出其在大豆異黃酮產(chǎn)業(yè)中的良好應(yīng)用潛力。BglP在纖維素降解方面也具有明顯的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，以Celluclast1.5L降解甘蔗渣為例，BglP可以提高轉(zhuǎn)化率1.9倍。當(dāng)反應(yīng)體系中存在高濃度葡萄糖(500 mM)或木糖（200 mM）時(shí)，BglP可以分別提高3.4和3.0倍的轉(zhuǎn)化率。⑵β-半乳糖苷酶BgalP克隆在表

6、達(dá)載體pET32a上，在大腸桿菌中獲得了可溶性表達(dá)，純化后的蛋白分子量為76 kDa，與理論分子量一致。酶學(xué)性質(zhì)結(jié)果顯示BgalP反應(yīng)的最適溫度為55℃，最適pH為6.5。BgalP的熱穩(wěn)定性很好，65℃的半衰期為8h。在以oNPG為底物時(shí)，比酶活為188 U/mg，優(yōu)于同家族中其他細(xì)菌來(lái)源的β-半乳糖苷酶。此外，BgalP對(duì)常見(jiàn)的有機(jī)溶劑具有很好的耐受能力，而目前的研究中，對(duì)于耐有機(jī)溶劑性質(zhì)的β-半乳糖苷酶鮮見(jiàn)報(bào)道，因此該β-半乳糖苷

7、酶可以應(yīng)用在含有機(jī)溶劑環(huán)境下的工業(yè)催化領(lǐng)域。⑶α-半乳糖苷酶AgalP克隆在表達(dá)載體pET32a上，純化后的蛋白分子量為86 kDa，但是是包涵體。采用鎳柱復(fù)性法對(duì)AgalP包涵體蛋白進(jìn)行了復(fù)性，復(fù)性率為25％。酶學(xué)性質(zhì)結(jié)果顯示，AgalP的最適反應(yīng)溫度為65℃，熱穩(wěn)定性好，65℃下的半衰期達(dá)到5.5 h。最適反應(yīng)pH為7.0，在pH5-10的范圍可保持較好的酸堿穩(wěn)定性。在以pNPGal為底物時(shí)，比酶活為22 U/mg，Km值為0.14