PCUGNA-PMI載體的構(gòu)建及利用GNA改良水稻抗蟲性.pdf

1、水稻(Oryza sativa L)是重要的糧食作物之一,中國有50﹪以上的人口以稻米為主食,而蟲害嚴重影響著水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn),實踐證明,抗蟲品種的應(yīng)用是最為經(jīng)濟有效的辦法.常規(guī)育種由于受到種質(zhì)資源稀缺和生殖隔離的限制,至今還未很好地解決水稻的抗蟲性.植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)和成熟,為我們解決這個問題提供了一條有效的途徑.但是,轉(zhuǎn)基因植株中的除草劑或抗生素抗性標記基因的環(huán)境和食品安全性一直頗有爭議,這限制了轉(zhuǎn)基因工作的發(fā)展和轉(zhuǎn)基因植物的更大面積

2、推廣.基于這一點,該研究將來源于大腸桿菌的6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)安全選擇標記基因和雪花蓮凝集素(GNA)抗蟲基因構(gòu)建于同一表達載體上進行遺傳轉(zhuǎn)化,其主要成果如下:1.構(gòu)建了一個包含抗蟲基因GNA、安全標記基因PMI和報告基因GUS的表達載體pCUGNA-PMI,其中GNA基因來自質(zhì)粒pCUGNA-bar,PMI基因來自質(zhì)粒pNOV2819,GUS基因來自質(zhì)粒pCAMBIA1301.2.對10個材料的成熟胚和幼胚進行誘導,實驗結(jié)果

3、表明:1)NB培養(yǎng)基適合幼胚培養(yǎng),而CC培養(yǎng)基適合成熟胚培養(yǎng).2)幼胚低溫處理效果不明顯,處理時間最好不超過3天;成熟胚進行適當?shù)牡蜏靥幚?其誘導效果可以得到改善.3)不同材料、不同外植體,第一次繼代時間不同,整體上幼胚比成熟胚第一次繼代時間早.4)不同材料、不同外植體可誘導率不同,其中幼胚出愈率比成熟胚高,粳稻出愈率比秈稻高.5)不同材料、不同外植和不同第一次繼代時間,愈傷組織的褐化趨勢不同.3.利用農(nóng)桿菌和基因槍介導法,分別將質(zhì)粒p

4、CUGNA-PMI和質(zhì)粒pCUGNA-hyg用于十個材料的轉(zhuǎn)化,質(zhì)粒pCUGNA-hyg的轉(zhuǎn)化獲得了較好的轉(zhuǎn)化效果,每個材料用農(nóng)桿菌法和基因槍法轉(zhuǎn)化都獲得了陽性植株,其中,以日本晴、ZH9和D香B的轉(zhuǎn)化率較高.而質(zhì)粒pCUGNA-PMI的轉(zhuǎn)化效果較差,基因槍法沒有得到綠苗,農(nóng)桿菌法僅得到14株綠苗,其中8株為陽性,日本晴有4株,ZH9有3株,501R有1株.4.隨機選取PCR陽性植株進行Southern blotting實驗,結(jié)果表明: