綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白與綿羊透明質(zhì)酸酶2相互作用初探.pdf

1、研究背景:綿羊肺腺瘤(Ovine pulmonary adenomatosis，OPA)是由綿羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV)引起的一種傳染性肺臟腫瘤性疾病。JSRV為β反轉(zhuǎn)錄病毒屬成員，其env基因主要編碼囊膜蛋白(JSRV-Env)，包括表面蛋白(SU)和穿膜蛋白(TM)兩個亞基。有研究表明，綿羊透明質(zhì)酸酶2(hyaluronidase2，Hyal-2)在綿羊體內(nèi)作為內(nèi)、外源性JSRV

2、細(xì)胞受體起作用。但有關(guān)綿羊Hyal-2與JSRV-Env及其亞基之間相互作用的研究資料尚比較缺乏。
　　研究目的:綿羊Hyal-2作為JSRV進(jìn)入綿羊機體細(xì)胞的受體起作用，因此，深入研究綿羊Hyal-2與JSRV-Env及其亞基(SU、TM)之間的相互作用，對于揭示JSRV侵染細(xì)胞及致瘤機理具有重要意義。
　　研究方法:
　　(1)運用重疊PCR方法擴增綿羊透明質(zhì)酸酶2基因(hyal-2)，并運用生物信息學(xué)軟件對其表達(dá)

3、蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。
　　(2)構(gòu)建綿羊透明質(zhì)酸酶2(Hyal-2)的真核表達(dá)載體，為后期建立相關(guān)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系及進(jìn)行病毒感染性試驗提供實驗平臺。
　　(3)構(gòu)建JSRV-Env及其亞基(SU、TM)真核表達(dá)載體，通過瞬時轉(zhuǎn)染及測序驗證真核表達(dá)載體的構(gòu)建是否成功;通過激光共聚焦方法觀察細(xì)胞內(nèi)蛋白之間的共定位情況;用免疫共沉淀法及雙分子熒光互補系統(tǒng)對受體與Env結(jié)合亞基進(jìn)行驗證。
　　(4)運用重疊PCR方法擴增缺失型su

4、基因，然后構(gòu)建一系列表達(dá)缺失型SU蛋白的真核表達(dá)載體，通過瞬時轉(zhuǎn)染及測序驗證真核表達(dá)載體的構(gòu)建是否成功;通過激光共聚焦方法觀察細(xì)胞內(nèi)蛋白之間的共定位情況;運用免疫共沉淀法及雙分子熒光互補系統(tǒng)對Hyal2與SU亞基可能結(jié)合區(qū)域進(jìn)行預(yù)測，為進(jìn)一步揭示JSRV致瘤機制奠定基礎(chǔ)。
　　(5)用熒光定量PCR方法檢測在小鼠NIH3T3細(xì)胞中單獨轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-(env、su、tm)載體后pik3ca基因和ras基因表達(dá)量的變化;用熒光

5、定量PCR方法檢測在小鼠NIH3T3細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-(env、su、tm)載體和pDsRed-monomer-N1-hyal2載體后pik3ca基因和ras基因表達(dá)量的變化。
　　研究結(jié)果:
　　(1)運用重疊PCR方法成功擴增出hyal-2基因，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測。
　　(2)成功構(gòu)建了攜帶紅色熒光蛋白報告基因的表達(dá)綿羊Hyal-2蛋白的真核表達(dá)載體。
　　(3)運用免疫共沉淀法和雙分子熒光

6、互補系統(tǒng)驗證了Hyal-2蛋白與Env及SU亞基蛋白的結(jié)合;運用激光共聚焦顯微鏡確定了Env和SU與Hyal-2蛋白之間存在共定位情況，TM與Hyal-2蛋白之間不存在共定位。
　　(4)成功構(gòu)建了一系列缺失型pEGFP-C1-(su1-su5)真核表達(dá)載體，并與pDsRed-monomer-N1-hyal-2共轉(zhuǎn)染，實現(xiàn)其在真核細(xì)胞中與Hyal-2蛋白的共表達(dá)。運用激光共聚焦方法確定了缺失型SU蛋白蛋白與Hyal-2蛋白之間存在

7、共定位情況;免疫共沉淀方法及雙分子熒光互補系統(tǒng)對受體與SU蛋白可能結(jié)合區(qū)域進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果表明SU1～SU5缺失型蛋白均不與綿羊Hyal-2蛋白結(jié)合，證明SU1～SU5蛋白所缺失的區(qū)域?qū)τ诰d羊Hyal-2蛋白與Env的結(jié)合及相互作用都是非常重要的。這為進(jìn)一步確定綿羊Hyal-2蛋白與SU蛋白結(jié)合位點奠定了基礎(chǔ)。
　　(5)熒光定量PCR方法檢測在小鼠NIH3T3細(xì)胞中單獨轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-(env、su、tm)后，pik3ca

8、基因和ras基因表達(dá)量與對照組相比顯著升高。分別共轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-(env、su、tm)和pDsRed-monomer-N1-hyal2后，pik3ca基因和ras基因表達(dá)量與對照組相比顯著降低。
　　研究結(jié)論:
　　(1)擴增出綿羊hyal2基因并對Hyal-2蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測，成功構(gòu)建了Hyal2真核表達(dá)載體且在293T細(xì)胞中獲得表達(dá)，Hyal2是分子質(zhì)量為54.190kD的一種親水性蛋白。
　　(2)構(gòu)建

9、了JSRV-Env及其亞基SU、TM的真核表達(dá)載體并實現(xiàn)其在293T細(xì)胞中的表達(dá)。
　　(3)用構(gòu)建的pEGFP-C1-(env、su、tm)真核表達(dá)表達(dá)載體與hyal-2真核表達(dá)載體pDsRed-monomer-N1-hyal2共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，實現(xiàn)其在293T細(xì)胞內(nèi)的共表達(dá)，證實Env、SU與Hyal2存在相互作用，TM與Hyal2未發(fā)生相互作用。
　　(4)缺失型su1-su5基因表達(dá)產(chǎn)物影響與Hyal-2蛋白的結(jié)合