白馬山金線蓮組培快繁關(guān)鍵技術(shù)研究及其藥用成分比較.pdf

1、花葉開唇蘭（Anoectochilus roxburghii(Wall.) Lindl.）即民間俗稱的金線蓮，同時(shí)擁有藥用、食補(bǔ)和觀賞三大價(jià)值。其來源地豐富，在我國境內(nèi)包括福建、廣西、臺(tái)灣等東南沿海至西南9個(gè)省份均有分布。金線蓮對(duì)生長環(huán)境的要求嚴(yán)苛，種子萌芽率低，生長緩慢，生產(chǎn)上多采用組培技術(shù)進(jìn)行繁殖。本試驗(yàn)以福建寧德白馬山的野生金線蓮為主要研究對(duì)象，對(duì)其工廠化的組培、人工種植技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化研究，對(duì)其不同代數(shù)的組培苗和福建省內(nèi)不同產(chǎn)地的野

2、生苗進(jìn)行ISSR遺傳穩(wěn)定性和多樣性分析，最后比較了它們之間多糖和總黃酮含量的區(qū)別。主要的研究內(nèi)容如下：
　　1.福建白馬山野生金線蓮與其它產(chǎn)地野生金線蓮的區(qū)別
　　本試驗(yàn)通過對(duì)福建寧德白馬山與省內(nèi)、外其它產(chǎn)地野生金線蓮?fù)庠谛螒B(tài)、ISSR遺傳多樣性和多糖、總黃酮含量的比較，明確了它們之間的區(qū)別性。
　　(1)通過將福建寧德白馬山與省內(nèi)南平、三明、龍巖、泉州，省外廣西、廣東、貴州野生金線蓮相比較，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)自寧德白馬山的金線蓮

3、葉片寬大更似心形，葉脈紅艷稀疏，葉緣較平滑，屬于中等大小。
　　(2)提取了福建寧德白馬山，省內(nèi)南平、三明、龍巖、泉州，省外廣西、廣東、貴州野生金線蓮的多糖和總黃酮，結(jié)果顯示：福建野生金線蓮多糖含量高于廣東、廣西和貴州野生樣本，其中寧德白馬山金線蓮的多糖含量為最高，泉州野生樣本與之相近，省外廣西野生樣本的含量為最低；而總黃酮含量上，寧德白馬山與三明野生金線蓮無顯著性差別并列第二，龍巖和廣東樣本的含量則并列第一。
　　(3)對(duì)

4、白馬山和省內(nèi)南平、三明、龍巖、泉州等4個(gè)主產(chǎn)區(qū)的野生金線蓮樣本進(jìn)行了DNA的提取，在優(yōu)選出的11條通用引物的基礎(chǔ)上經(jīng)過ISSR-PCR擴(kuò)增程序反應(yīng)后，其總共擴(kuò)增出了100條譜帶，而多態(tài)性條帶達(dá)到了72條，占總體的72％；以寧德白馬山野生金線蓮為比較標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算福建省內(nèi)其它產(chǎn)地的野生樣本變異率，可發(fā)現(xiàn)泉州野生金線蓮為50.00%，龍巖野生金線蓮為62.50%，三明野生金線蓮為58.33%，南平野生金線蓮為60.42%；根據(jù)聚類分析的結(jié)果，福

5、建省內(nèi)不同產(chǎn)地的野生樣本遺傳相似系數(shù)介于0.58-0.92之間，遺傳距離較大，可見福建省內(nèi)各地區(qū)的野生金線蓮存在著豐富的多樣性。
　　2.福建白馬山金線蓮組織培養(yǎng)工廠化育苗的主要技術(shù)研究
　　本試驗(yàn)通過將福建白馬山金線蓮作為主要的研究對(duì)象，探究了無菌體系的建立，不同的處理對(duì)金線蓮莖段增殖的影響，不同的培養(yǎng)基對(duì)金線蓮芽苗生根的作用，不同的添加物組合對(duì)金線蓮壯苗培養(yǎng)的效果，最后比較了六種LED不同的光質(zhì)對(duì)金線蓮組培苗生長的影響。

6、
　　(1)通過比較金線蓮不同的取材部位在0.1%升汞溶液中不同的浸泡時(shí)間，研究最佳的滅菌組合。結(jié)果為金線蓮的頂部莖段最適合作為建立無菌體系的部位，同時(shí)采用9 min的消毒時(shí)間效果最佳，其存活率為76.67%，污染率為21.67%。
　　(2)增殖階段通過不同濃度的MS培養(yǎng)基、6-BA和NAA，配以不同的莖段位置設(shè)計(jì)了一個(gè)四因素、三水平的正交試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳的組合是以金線蓮中部莖段為增殖材料，其更優(yōu)于頂芽和基部，在1

7、/2 MS+6-BA2.4mg/L+ NAA0.1mg/L+白糖25g/L的培養(yǎng)基上，增殖系數(shù)可達(dá)到4.02。
　　(3)通過以1/2MS為基本培養(yǎng)基，采用四因素三水平的正交試驗(yàn)，探究AC、IBA以及NAA對(duì)于金線蓮芽苗生根的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，AC和IBA對(duì)金線蓮生根的影響顯著。篩選出金線蓮最佳的生根組合是1/2MS+ AC0.5g/L+ NAA1.5mg/L+ IBA1.5mg/L+白糖30 g/L，其平均根數(shù)達(dá)到2.1條。<

8、br>　　(4)以白馬山金線蓮芽苗為材料，在優(yōu)選的生根培養(yǎng)基上比較白糖、香蕉泥、土豆泥、洋蔥泥和花寶1＃這些添加物的組合對(duì)其壯苗的影響。經(jīng)過賦值評(píng)分法對(duì)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)香蕉泥的添加在金線蓮壯苗中起到主要的作用。即最適宜的壯苗培養(yǎng)基為1/2MS+ NAA1.5 mg/L+ IBA1.5mg/L+ AC0.5g/L+白糖20g/L+香蕉泥60g/L+土豆泥60g/L+洋蔥泥60 g/L+花寶1＃2 g/L。
　　(5)本試驗(yàn)在優(yōu)化的壯

9、苗配方基礎(chǔ)上，使用單因素法旨在通過對(duì)比LED紅、黃、藍(lán)、綠、白、暖白光，并以日光燈為對(duì)照，研究不同的光源對(duì)金線蓮組培苗生長的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LED暖白光的效果最佳，其中紅、黃、綠容易使植株出現(xiàn)徒長、細(xì)弱的現(xiàn)象，藍(lán)光對(duì)苗的生長有益能夠抑制拔高，而暖白和白光則能夠使植株粗壯，增大葉面積。
　　3.福建白馬山金線蓮組培苗人工移栽的試驗(yàn)研究
　　選擇組培3個(gè)月左右，株高達(dá)到5-6 cm，有2-3條主根，4片以上葉片，生長健壯的植株為移

10、栽對(duì)象。比較不同的種植基質(zhì)，廣譜性殺菌劑的組合以及兩種緩釋肥的不同用量對(duì)人工移栽的影響。
　　(1)在對(duì)比不同基質(zhì)配比的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)泥炭：珍珠巖：蛭石：松樹皮=2:1:1:1是最佳的移栽基質(zhì)，成活率100%，長勢最優(yōu)。
　　(2)在優(yōu)化的移栽基質(zhì)上，分別以不同倍數(shù)的多菌靈、百菌清、代森錳鋅、甲基托布津以及腐霉利兩兩配對(duì)，對(duì)移栽苗進(jìn)行輪換澆施，比較它們對(duì)金線蓮病害的防治。結(jié)果為以50%的多菌靈1000倍配以70%的甲基托布津1

11、000倍輪換使用對(duì)病害的防治效果最佳，同時(shí)也促進(jìn)了植物的生長，增加產(chǎn)量。
　　(3)按照好康多1號(hào)和奧綠601兩種緩釋肥不同的施用量對(duì)白馬山金線蓮移栽苗進(jìn)行施用，并與清水對(duì)照組比較。通過賦值評(píng)分法的處理，試驗(yàn)結(jié)果為在15寸種植盤移栽時(shí)施以好康多1號(hào)13 g是最有利于金線蓮的增產(chǎn)，其鮮重、粗度、高度增量比對(duì)照分別增加了145.16%、400%以及193%，葉大舒展、葉脈鮮紅且有兩片新葉。
　　4.福建白馬山金線蓮組培苗遺傳穩(wěn)定

12、的ISSR分析
　　本試驗(yàn)對(duì)福建白馬山金線蓮0代、3代、6代和9代的組培苗進(jìn)行了ISSR遺傳穩(wěn)定性的檢測分析。使用11條通用引物對(duì)不同代數(shù)的福建白馬山金線蓮組培苗的DNA進(jìn)行PCR 的擴(kuò)增，結(jié)果顯示擴(kuò)增出的總條帶為96條，總的多態(tài)性帶數(shù)為30條，多態(tài)性達(dá)到31.25%。與初代相比3代、6代、9代的變異率分別為9.38%、10.42%、12.50%。0-9代的遺傳相似系數(shù)在0.813-0.990之間，遺傳相似性很大。雖然從

13、第3代開始，隨著代數(shù)的上升變異率會(huì)逐步擴(kuò)大，組培苗發(fā)生了一定的變異，但變異率上升幅度并不大，其遺傳性狀依然較為穩(wěn)定，主要藥用成分含量與野生植株差別不大，可作為生產(chǎn)使用。
　　5.福建白馬山金線蓮與其它產(chǎn)地金線蓮組培苗藥用成分的測定與分析
　　本試驗(yàn)以福建白馬山金線蓮組培苗和移栽苗為主，以省外其它產(chǎn)地的為比照，探究它們主要藥用成分中多糖和總黃酮含量的變化。
　　(1)將福建寧德白馬山、廣西、江西和臺(tái)灣金線蓮培養(yǎng)3個(gè)月左右

14、的瓶苗與其移栽2和3個(gè)月的大棚苗進(jìn)行多糖和總黃酮的提取比較。發(fā)現(xiàn)相較于其它樣本，白馬山金線蓮多糖含量較高，總黃酮含量為最高。而且在移栽初期各品種無論是多糖還是總黃酮含量都有所降低，但隨著種植時(shí)間的延長，它們都呈現(xiàn)出了上升的趨勢。
　　(2)福建寧德白馬山金線蓮在經(jīng)過LED紅、黃、藍(lán)、綠、白、暖白光下培養(yǎng)90 d后，測定其與日光燈處理下苗的多糖、總黃酮含量的變化，發(fā)現(xiàn)LED中紅光最有益于多糖的積累，LED藍(lán)、綠光則最能促進(jìn)總黃酮含量