菠菜Y染色體特異EST序列的快速克隆及生物信息學(xué)分析.pdf

1、菠菜（SpinaciaoleraceaL.），又名波斯菜、田菜等，通常為雌雄異株植物，雌株和雄株在形態(tài)上有明顯差異，雄株花常呈穗狀，著生于花莖的頂端或葉腋處，雌株花常多個花蕾成團著生于葉腋處，其性別決定方式為XY型，性染色體演化水平處于性染色體演化的第二階段。菠菜的染色體組(2n=12)較小，單個染色體組的基因組大約為1000Mbp，是雌雄異株植物中研究植物性別分化非常好的實驗材料。目前已有細(xì)胞學(xué)研究證明菠菜最大的一條染色體（1號染色體

2、）上具有性別決定相關(guān)的X、Xm、Y三個復(fù)等位基因，為菠菜的性染色體，雄性菠菜的基因型為XY，雌性菠菜的基因型為XX。目前X、Xm、Y三個復(fù)等位基因位點尚未被成功克隆，并且尚未有菠菜性染色體連鎖功能基因克隆的報道，同時菠菜的性別決定基因尚未被發(fā)現(xiàn)、性別決定分子機制尚不清楚。
　　基于上述問題，本研究采用染色體顯微分離與雜交特異性擴增(hybridsequenceamplification，HSA)相結(jié)合的一種較為新型的技術(shù)方法，將菠

3、菜Y染色體DOP-PCR產(chǎn)物與雄性菠菜開花期花的cDNA雜交，以雌性菠菜基因組作為封阻，構(gòu)建了Y染色體上特異表達(dá)的cDNA文庫，并對cDNA文庫中的EST序列進(jìn)行了克隆、測序及生物信息學(xué)分析。本文獲得了多個菠菜Y染色體特異表達(dá)的EST序列，為菠菜性別決定和性別分化機制的研究提供了理論依據(jù)，同時為植物性染色體演化的研究提供了一定的研究基礎(chǔ)。主要研究成果如下:
　　1.成功對菠菜Y染色體進(jìn)行了顯微分離及DOP-PCR擴增，并進(jìn)行了來源

4、驗證和分析;
　　2.成功建立了一種新型的快速克隆菠菜Y染色體特異EST序列的技術(shù)方法體系;
　　3.構(gòu)建了菠菜Y染色體上特異表達(dá)的cDNA文庫，獲得了90條有效的EST序列，片段大小介于53～486bp之間。經(jīng)Blastn同源比對分析，有12條EST序列具有同源核酸序列，物種分布于菠菜、無油樟、擬南芥、垂枝樺、蓖麻等植物中。經(jīng)Blastx同源比對分析，有25條EST序列具有同源的編碼蛋白的核酸序列，物種分布于葡萄、水稻、大

5、洋洲濱藜等物種中。使用Blast2Go，以1E-10作為臨界值，進(jìn)行EST序列的基因本體(GO)的注釋，其中有18條EST序列具有523個GO功能注釋，其中生物學(xué)途徑結(jié)果有367個，占70.17％;細(xì)胞組件注釋結(jié)果有44個，占8.41％;分子功能注釋結(jié)果有112個，占21.42％。
　　4.綜合Blastn和Blastx分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)EST序列SP1-60與菠菜編碼過氧化物酶的mRNA序列具有98.60％的相似性;EST序列SP2

6、-52與擬南芥線粒體half-ABC轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的mRNA序列相似性有98.96％的相似性，ABC轉(zhuǎn)運蛋白與植物生長發(fā)育及抗逆生長等生理活動相關(guān);EST序列SP3-12與垂枝樺組氨酸激酶3的mRNA序列相似性達(dá)87.64％;EST序列SP4-42與日本鰻鱺中編碼RecA家族中的DMC1的eDmc1mRNA序列相似性達(dá)96.58％，DMC1與動物雄性的性別發(fā)育及植物的減數(shù)分裂相關(guān)，缺失DMC1基因則可能會導(dǎo)致雄性不育現(xiàn)象及染色體碎片的形成

7、;EST序列SP5-13與蓖麻鐵轉(zhuǎn)運蛋白的mRNA序列相似性達(dá)99.80％，鐵轉(zhuǎn)運蛋白與植物生長及胚胎發(fā)育相關(guān);EST序列SP5-62與大洋洲濱藜S-腺苷-L-蛋氨酸合酶4的AnSAMS4mRNA序列相似性達(dá)81.88％。
　　結(jié)果表明:EST序列SP2-52、SP4-42和SP5-13可能在菠菜雄性植株的生長發(fā)育過程、雄性性別的分化及減數(shù)分裂過程中都起到一定的作用，可能對于菠菜的雄性性別決定起到一定作用，但其作用機制還有待后續(xù)實