重組牛生長激素注射于泌乳水牛后潛在生物靶標的研究.pdf

1、生長激素(Growth hormone,GH),又稱促生長素,它是由腦垂體前葉嗜酸性細胞分泌的一類單鏈肽激素,與催乳素(PRL)和胎盤催乳素(PL)同屬于1個基因家族,廣泛存在于各種脊椎動物中。它的主要作用是刺激機體生長,提高組織和細胞新陳代謝。重組牛生長激素(Recombinant bovine growth hormone,rbGH)如今被美國等國家廣泛用于畜牧生產(chǎn)中,將其注射奶牛,可顯著提高奶牛的產(chǎn)奶量。研究發(fā)現(xiàn),注射了rbGH的

2、奶牛會出現(xiàn)極其嚴重的乳房炎、跛行、生殖障礙等疾病,而攝入這種牛奶的人們也存在更高的致癌風險。據(jù)此歐盟成員國和加拿大明令禁止使用rbGH,但是濫用rbGH以獲得暴利仍無法避免。
　　為了有效監(jiān)管rbGH的使用,建立一套檢測方法來鑒定動物是否注射了rbGH顯得極為重要。由于rbGH和天然bGH具有極高的相似性,通過直接檢測方法區(qū)分這兩者是極其困難的。因此,開發(fā)包括生物靶標在內(nèi)的間接分析方法則可能是檢測rbGH有效的替代方案。本研究主要

3、分為兩大部分:1)制備針對rbGH的單克隆抗體,建立檢測血清GH、血清胰島素樣生長因子(IGF-1)和牛奶IGF-1的雙夾心ELISA方法;2)建立檢測外周血白細胞差異表達基因靶標的方法。
　　由于目前對水牛尚無GH研究的相關(guān)報道,本研究以水牛為模式動物,應(yīng)用韓國LG生命科學(xué)公司的rbGH注射8頭泌乳水牛,每兩周注射1次,共注射5次,持續(xù)10周(每2周為一個周期,共5個周期)。血液樣品于每次rbGH注射后的第2、5、9、14天收集

4、;牛奶樣品從第1和第5周期的第2、7、14天收集;外周血白細胞樣品收集于每個注射周期的第2和第14天。
　　為了區(qū)分高度相似的rbGH和天然bGH,本研究制備了具有高度特異性和敏感性的單克隆抗體2A3和3G6,其中2A3能將高度相似的rbGH和天然bGH完全區(qū)分開。建立了三種雙夾心ELISA方法分別檢測血清GH、血清IGF-1及牛奶IGF-1的水平。并用統(tǒng)計學(xué)方法驗證這三種方法的靈敏性、特異性、準確性和可重復(fù)性,證實了方法的有效性

5、。同時,它們的最低檢出值可分別達到0.089ng/ml、20ng/ml、0.025ng/ml。
　　雙夾心ELISA檢測的結(jié)果顯示:1)與對照組相比,在每次rbGH注射后的第2天,實驗組水牛血清中GH的水平顯著的升高(p<0.001),盡管隨后就迅速下降,但是在第5天仍顯著高于對照組(p<0.001),到第9和14天才恢復(fù)到了基礎(chǔ)水平?？梢?血清GH含量能作為檢測水牛是否注射rbGH的一個良好和可靠的指標,但是血清GH含量在達到峰

6、值后迅速下降的現(xiàn)象限制了樣品檢測的時間。2)在rbGH注射后的第2天,實驗組水牛血清中IGF-1的濃度迅速提高(p<0.001),并在第5天或第9天達到峰值。盡管在第14天,血清IGF-1的含量已有所下降,但其平均值仍顯著高于對照組(p<0.01)。表明血清IGF-1含量的檢測比起血清GH具有更長的檢測周期,在rbGH注射后兩周內(nèi)采集樣品都能檢測到。而且,如果用該檢測方法發(fā)現(xiàn)在同一養(yǎng)殖場的動物血清中都檢測出高濃度的IGF-1則是注射了r

7、bGH的重要判斷依據(jù)。3)水牛奶中IGF-1的含量在整個rbGH注射周期中都顯著增加,在第2天(p<0.001)和第7天(p<0.01)達到峰值,比對照組高出2.3倍。由于牛奶中高水平IGF-1對公共衛(wèi)生的潛在危害,因此注射rbGH后水牛奶中較高濃度的IGF-1,不單單只作為鑒定rbGH注射的指標,更是在食品安全中需要密切監(jiān)測的對象。
　　運用基因芯片篩選到了rbGH注射水牛和對照水牛外周血白細胞中的差異表達基因,發(fā)現(xiàn)其中有110

8、個基因出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào),并從中篩選出10個差異最明顯,表達最穩(wěn)定的基因(ABCG1,DQA1,DQA5,DQB,DLC,Ferritin-like heavy chain,Integrinβ-fragment,KKCC,TKDP3,SUCLG)。隨后運用實時定量PCR技術(shù)檢測水牛外周血白細胞中這10個通過基因芯片技術(shù)篩選出來的基因,以及15個基因的表達水平,其中包括屬于生長軸的10個基因(GHR、IGF-1、IGF-2、IGFBP-1、-

9、2、-3、-4、-5、-6、IGF-1R),5個生長激素受體5非翻譯區(qū)的突變體(1B、1C1、1C3、1D、1I)。結(jié)果顯示,rbGH顯著地影響著水牛外周血白細胞中一些基因的表達(IGFBP-1,p<0.001;DQA5,p<0.01;DQB p<0.05;DLC p<0.001;Ferritin-like heavy chain,p<0.05;Integrinβ-fragment,p<0.05)。其中DQA5的表達水平在注射了rbGH

10、后顯著地增加并維持在較高的水平,未注射rbGH的水牛幾乎無法檢測到DQA5的表達(其中只有一頭患乳房炎的水牛檢測到了DQA5的高表達)。由此可見,DQA5也能作為鑒定rbGH注射的生物靶標,但是必須謹慎使用,以防假陽性的出現(xiàn)。
　　本研究通過建立免疫分析和基因靶標檢測方法來鑒定模式動物水牛是否注射了rbGH,并且通過潛在生物靶標(包括血清GH、血清IGF-1、牛奶IGF-1及25個水牛外周血白細胞基因)的檢測,證實了所建立方法的可