海洋桔青霉W1抗真菌蛋白的分離純化與特性研究.pdf

1、植物致病真菌是造成主要糧食和經(jīng)濟(jì)作物減產(chǎn)的頭號(hào)殺手，目前大量使用的化學(xué)農(nóng)藥已經(jīng)對(duì)環(huán)境和人類健康造成了巨大的負(fù)面影響。同時(shí)開發(fā)新型化學(xué)農(nóng)藥的高成本及耐藥微生物的迅速出現(xiàn)等因素，引起我們對(duì)生物農(nóng)藥的關(guān)注。其中，抗真菌蛋白因其來源廣泛及其獨(dú)特的作用機(jī)制，為新型抗真菌活性物質(zhì)的研究提供了重要信息，并成為了研究熱點(diǎn)。此外，陸地生物資源已被大量開發(fā)，發(fā)現(xiàn)新型抗菌物質(zhì)的可能性不斷下降，迫切需要尋找新的來源。海洋提供了非常特殊的生態(tài)環(huán)境，使海洋微生物能

2、夠進(jìn)化出特殊的代謝途徑，產(chǎn)生更多新型的抗菌活性物質(zhì)，將在植物病原菌治理及活性物質(zhì)開發(fā)方面發(fā)揮重要作用，因此，從海洋微生物中分離抗真菌蛋白具有重要的研究意義。
　　為了從海洋中尋找具有高效抗菌活性的天然產(chǎn)物，本研究首先采用平板稀釋法和平板擴(kuò)散法從深海中篩選活性菌株。通過使用不同配方的培養(yǎng)基，對(duì)采集自各種海洋環(huán)境（大洋、北極和南極）的深海樣品進(jìn)行微生物菌株的分離篩選，篩選到了300余株真菌以及大量的細(xì)菌，其中包括了許多具有抗菌活性的微

3、生物。接著以7株植物病原真菌和7株致病細(xì)菌為指示菌進(jìn)一步篩選并鑒定出具有高效抗菌活性的菌株，植物病原真菌包括宛氏擬青霉、膠孢炭疽菌、尖孢鐮刀菌、綠色木霉、立枯絲核菌、長(zhǎng)柄鏈格孢和核盤菌，致病細(xì)菌包括金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、溶壁微球菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、嗜水氣假單胞菌和黃單胞菌。本研究共分離到57株具有抗植物病原菌活性的菌株，包括53株活性真菌和4株細(xì)菌，分別鑒定種屬并統(tǒng)計(jì)活性情況和樣品來源，為研究海洋抗菌微生物資源以及開發(fā)新型

4、抗菌活性物質(zhì)奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　更重要的是，本研究從西南印度洋底泥樣品中分離并鑒定出一株桔青霉，命名為W1。該菌株的發(fā)酵上清對(duì)多株植物病原菌具有拮抗活性，并通過采用鹽析、透析、凍干、陰離子交換色譜、陽離子交換色譜、超濾濃縮等方法，最終從海洋桔青霉W1發(fā)酵液上清中分離純化到一種抗真菌蛋白，將它命名為PcPAF。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，PcPAF的分子量大小約為10kDa。通過MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定以及N端測(cè)序分

5、析該蛋白的序列，根據(jù)分析結(jié)果判斷PcPAF可能為一種新的抗真菌蛋白，并檢測(cè)了該抗真菌蛋白的理化性質(zhì)。結(jié)果表明PcPAF對(duì)4株植物病原菌真菌，綠色木霉、宛氏擬青霉、長(zhǎng)柄鏈格孢和膠孢炭疽菌具有較強(qiáng)的抑制活性，紙片法檢測(cè)PcPAF對(duì)綠色木霉、尖孢鐮刀菌、宛氏擬青霉以及長(zhǎng)柄鏈格孢的最低抑制濃度分別為1.52μg/disc、6.08μg/disc、3.04μg/disc和6.08μg/disc。PcPAF在80℃條件下處理20min其活性不受影響

6、;能夠耐受多種金屬離子處理，經(jīng)過20mM的Mn2+處理后，能保持75％的抗菌活性;可以耐受酸性環(huán)境，并在弱酸環(huán)境中顯示出最好的抗菌活性;此外，PcPAF對(duì)紫外輻射，多種有機(jī)溶劑、表面活性劑以及蛋白酶都有較好的耐受能力，在一般條件下都能保持較好的抗菌活性。PcPAF與已經(jīng)報(bào)道的真菌來源的抗真菌蛋白在序列和性質(zhì)上都存在一定差異，可能是一種新的真菌來源的抗真菌蛋白。通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入甘氨酸能夠明顯挺高海洋桔青霉W1發(fā)酵上清的抗菌活性，抗菌