一種基于免疫沉淀的病原弧菌外膜蛋白抗原篩選新方法的初步建立.pdf

1、弧菌病在全球范圍內(nèi)暴發(fā)性流行,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失,而且嚴(yán)重威脅人類健康。鑒于化學(xué)藥物防治存在諸多弊端,采用疫苗免疫防治成為目前控制弧菌病的重要途徑。弧菌的外膜蛋白(Outerme mbrane protein,OMP)是重要的疫苗候選蛋白的來源,篩選具有免疫原性的弧菌外膜蛋白,開發(fā)弧菌多價(jià)疫苗,對弧菌病的防治具有重大意義,但現(xiàn)行的病原菌外膜蛋白抗原主要篩選方法中,反向疫苗學(xué)工作量太大,而傳統(tǒng)的免疫蛋白組學(xué)也要采用繁雜的二維電

2、泳。
　　為了更簡單、快捷地篩選鑒定弧菌外膜蛋白抗原,本研究以兩種常見病原弧菌副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌為模型,建立了一種基于免疫沉淀的弧菌外膜蛋白抗原篩選新方法。首先,制備弧菌全菌抗血清,能與弧菌全菌發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。然后,全菌細(xì)胞與抗血清孵育,離心洗去未結(jié)合的血清成份,裂解細(xì)胞,沉淀免疫復(fù)合物。最后,采用一維電泳分離沉淀出的外膜蛋白抗原,并進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定。兩個(gè)模型成功篩選到了8個(gè)外膜蛋白抗原,其中OmpU、OmpA和LamB已經(jīng)

3、被證實(shí)具有免疫原性,初步說明新方法的可行性。
　　為了客觀地評價(jià)新方法,進(jìn)一步以兩種常見病原弧菌弧菌副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌為模型,采用傳統(tǒng)的免疫蛋白組學(xué)方法作為對照。通過一維電泳的方法分離的外膜蛋白14個(gè)免疫印記顯色的蛋白條帶中13個(gè)蛋白條帶含兩種或兩種以上蛋白;在擬態(tài)弧菌模型中,印記膜上的免疫顯色條帶無法在電泳凝膠中相同的位置上找到。這說明在傳統(tǒng)免疫蛋白組學(xué)中,外膜蛋白分離不徹底會影響免疫檢測結(jié)果,無法判斷免疫顯色條帶中,哪個(gè)蛋白

4、參與了免疫反應(yīng)。另外一些低拷貝而免疫原性強(qiáng)的蛋白通過傳統(tǒng)的免疫蛋白組學(xué)無法篩選出來,而新方法中就克服了以上問題,說明了新方法的優(yōu)越性。
　　最后,通過對只在新方法篩選到的外膜蛋白抗原副溶血弧菌的OmpU和BtuB蛋白以及傳統(tǒng)免疫蛋白組學(xué)也可能篩選到的外膜蛋白抗原副溶血弧菌的OmpC進(jìn)行重組表達(dá)純化和免疫學(xué)性質(zhì)分析。結(jié)果表明,三種外膜蛋白都具有免疫原性,其中OmpC在溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌、霍亂弧菌、河弧菌和弗尼斯弧菌之間更是具有交叉免