廣西三黃雞MD抗性相關(guān)基因的篩選研究——BF基因可變剪切外顯子7qPCR技術(shù)的建立和應(yīng)用.pdf

1、馬立克氏病(Marek's disease，MD)是由馬立克氏病毒(Marek'sdisease virus，MDV)引起的對雞具有免疫抑制性的惡性T淋巴細(xì)胞腫瘤病，給養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。廣西三黃雞是一種具有優(yōu)良生產(chǎn)性能和經(jīng)濟價值的地方品種。近年來本實驗室對廣西區(qū)三黃雞MD流行病學(xué)的調(diào)查研究顯示，免疫過CVI988/Rispens或814的雞群MD也時有發(fā)病。因此除了對雞群采取有效的免疫防控和生物安全措之外，應(yīng)該通過抗病育種的手段

2、從遺傳本質(zhì)上提高三黃雞的抗MD能力。之前本課題組已發(fā)現(xiàn)雞的BF基因可變剪切外顯子7與其MD抗性相關(guān)。
　　 本文首先采用實驗室建立的半巢式PCR快速檢測雞BF基因可變剪切外顯子7的技術(shù)對父母代公雞的BF基因外顯子7進(jìn)行篩選，然后通過常規(guī)繁育方法分別獲得三組子代，即K組(父母代公雞BF基因有外顯子7)、Y組（父母代公雞BF基因無外顯子7）和對照的P組（父母代公雞未經(jīng)BF基因外顯子7篩選）。4日齡時，每組各取100羽雞以MDV-1強

3、毒株120015按500PFU/羽(0.2mL)腹腔注射進(jìn)行攻毒。試驗雞按常規(guī)方法飼養(yǎng)，每天統(tǒng)計死亡情況，試驗于攻毒后第10周結(jié)束，剖殺所有雞只。所有試驗期間死亡的個體以及試驗結(jié)束剖殺的雞只均解剖觀察腫瘤病變并采集病變組織進(jìn)行MDV的PCR檢測。結(jié)果K組、Y組和P組的腫瘤發(fā)生率和死亡率分別為32.97％和52.75％、53.85％和71.43％、42.39％和63.04％，各組之間差異顯著(p＜0.05);K組、Y組和P組試驗雞的BF基

4、因外顯子7檢測陽性率分別為42.86％(39/91)，19.57％(18/92)和30.77％(28/91)，并結(jié)合腫瘤發(fā)生率進(jìn)行卡方檢驗得出卡方值x2和P值分別為9.548a、-0.002，6.907a、-0.009以及4.866a、0.027，表明三組試驗雞攻毒后腫瘤的發(fā)生與否都與BF基因外顯子7的有無成顯著相關(guān)(p＜0.05);所有試驗雞中，具有BF基因外顯子7和無外顯子7的個體的腫瘤發(fā)生率分別為22.35％(19/85)和52.

5、38％(99/189)，差異顯著(p＜0.05)。實驗之二，對BF基因有外顯子7的20個樣本和BF基因無外顯子7的10個樣本分別進(jìn)行克隆和測序，所得序列與已報道的MD抗性單倍體B21、B12、B5、B2及MD易感單倍體B19、B15、B13進(jìn)行比對和遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示20條BF基因有外顯子7的序列中有10個與抗性單倍型相同，10條BF基因無外顯子7的序列中有4個與易感單倍型相同，且它們分別在2個特征性位點上完全符合，即抗性單倍型的3

6、S和87R、易感單倍型則為3P和87S;實驗之三，課題制備和構(gòu)建了BF基因可變剪切外顯子7和內(nèi)參基因β-acting的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒與實時定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用建立的實時定量PCR技術(shù)檢測試驗雞在MDV攻毒后不同時相BF基因可變剪切外顯子7（胞質(zhì)尾區(qū)含外顯子7或不含外顯子7）的mRNA表達(dá)水平。經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，BF基因有外顯子7和無外顯子7mRNA的表達(dá)水平在攻毒后的第4d差異不顯著(p=0.6377＞0.05)，第7d差異顯著(p=

7、0.0443＜0.05)，第14d、21d和28d差異極顯著(p＜0.01)。此外，BF基因有外顯子7mRNA的表達(dá)水平在MDV攻毒后的第7-28d一直維持著較高的水平，而BF基因無外顯子7mRNA的表達(dá)水平則有較大幅度的下降。實驗之四，建立了快速檢測BF基因可變剪切外顯子7的PCR方法，并采用此方法檢測300份雞BF基因樣品，經(jīng)測序鑒定與舊半巢式PCR技術(shù)檢測結(jié)果不相符的樣品，證實新方法準(zhǔn)確性更高，檢測時間也大為縮短，可在抗性育種的實