利用全外顯子組深度測序技術篩選和驗證膀胱移行細胞癌中的突變基因.pdf

1、目的：利用全外顯子組深度測序技術發(fā)現和篩選膀胱移行細胞癌(Transitional Cell Carcinoma Of Bladder，TCCB)中的致病候選突變基因，然后，應用Sanger測序技術進行驗證，為膀胱癌病因學研究提供一定的理論依據，并探尋理想的腫瘤診斷標志物和有效的治療靶點。
　　方法：
　　第一部分，取蘇州大學附屬第一醫(yī)院2012年4月手術治療的4對膀胱移行細胞癌患者的癌及癌旁組織，其中2個病例為非肌層浸潤性

2、（非浸潤組），2個病例為肌層浸潤性（浸潤組）。采用SOLID深度基因測序的方法進行全外顯子組測序，并通過特定的篩選條件進行過濾，選出其中突變的候選致病基因。
　　第二部分，Sanger測序標本：一部分為蘇州大學附屬第一醫(yī)院病理科提供的2011年9月至2013年5月膀胱移行細胞癌手術切除標本50例，其中浸潤性26例，非浸潤性24例；另一部分來自江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院病理科提供的2010年3月至2012年12月膀胱移行細胞癌術后石蠟

3、包埋切片組織49例，其中浸潤性35例，非浸潤性14例；另取10例癌旁組織作為對照。應用Sanger測序技術驗證深度測序中的突變結果。然后，采用免疫組化Envision二步法檢測制作的25例蠟塊，觀察HECW1（HECT，C2 and WW domain-containing protein1）蛋白在癌組織和癌旁組織中的表達差異。
　　結果：
　　第一部分：深度測序結果數據質量滿意，測序長度為75bp，準確度＞99％，平均覆蓋

4、度51×，捕獲效率62%，覆蓋度5×以上達92%。經過篩選和過濾，發(fā)現眾多突變基因，非浸潤組候選基因有38個，浸潤組有40個，非浸潤組和浸潤組共有的候選基因有20個；而非浸潤組中插入和缺失（INDEL）有5個，浸潤組有3個，兩組共有的有1個。將在外顯子上檢測到的突變候選基因，經過文獻檢索和復習，挑選出有功能介紹和與腫瘤相關的基因，分別是：IVL、RGPD5和ZNF79位于非浸潤組中；SRGAP2、FMN2、MUC6、CPNE7、MMP9

5、、MAGEE1和TRO位于浸潤組中；MUC4、HECW1和CTBP2是兩組共有的。其中，RGPD5可能參與了RAS-MAPK信號通路；CTBP2和HECW1可能在Wnt信號通路中起作用；而HECW1和MAGEE1均參加了泛素蛋白酶體信號途徑；MUC4能夠與ERBB2結合成復合體，在ERBB2信號通路中有著重要的作用；FMN2、CPNE7和MMP9在細胞周期調節(jié)和P53信號通路中對凋亡有著重要的影響。
　　第二部分：將在外顯子中檢測

6、到的13個經過文獻檢索和復習的有功能的基因再次行SNP和標準核苷酸BLAST比對，發(fā)現其中有6個非同義突變基因，分別是：IVL、RGPD5、CPNE7、ZNF97、HECW1和TCHH；5個同義突變基因，分別是：FMN2、MMP9、TRO、MAGEE1和MUC4。先選取非同義突變中4個基因（CPNE7、ZNF79、IVL、HECW1）應用Sanger測序驗證，99例膀胱癌組織中僅有HECW1發(fā)現6例基因突變，比例為6.06%，均為點突變

7、，位于第11號外顯子，且與深度測序突變位點相同或在附近區(qū)域。其中，38例非浸潤性膀胱癌組織DNA中，1例同義突變，比例為2.63%；61例浸潤性膀胱癌組織DNA中，4例錯義突變和1例無義突變（即突變?yōu)榻K止密碼子），比例為8.20%，兩者突變比例無統計學意義（P>0.05），對照組10例未發(fā)現突變。不同醫(yī)院來源的標本中，鹽城市一院標本發(fā)生突變的比例（8.10%）明顯高于蘇大附一院（4%），兩者比較未發(fā)現有明顯差異（P>0.05）。免疫組化