屈側(cè)網(wǎng)狀色素異常癥致病基因全基因組外顯子測(cè)序搜尋及POFUT1基因突變分析.pdf

1、研究背景：屈側(cè)網(wǎng)狀色素異常癥（Reticular pigmented of the flexures，RPAF,OMIM number:179850）又稱為Dowling-Degos?。―owling-Degos disease，DDD），是一種少見(jiàn)的常染色體顯性遺傳性皮膚病。早期有學(xué)者認(rèn)為該病是黑棘皮病的一種良性異型。1978年，Wilson-Jone等正式將該病命名為屈側(cè)網(wǎng)狀色素異常癥。該病好發(fā)于腕部、頸部、腋窩、腹股溝、乳房下及四

2、肢屈側(cè)等，臨床上主要表現(xiàn)為網(wǎng)狀分布的深褐色斑疹。男女均可發(fā)病，發(fā)病年齡變化較大，從青春期早期到中年期不等。2006年，Betz等對(duì)2個(gè)屈側(cè)網(wǎng)狀色素異常癥家系行全基因組掃描，將致病基因定位于12q，LOD值為4.42。此區(qū)域含有Ⅱ型角蛋白，對(duì)這些角蛋白基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，2個(gè)家系中的患者均在角蛋白5（keratin5，KRT5）存在突變，對(duì)照人群無(wú)突變，從而確定角蛋白5為DDD的致病基因。但，仍有一些家系或散發(fā)病例未在該基因上發(fā)現(xiàn)任何突變。20

3、06年，Li等對(duì)1個(gè)中國(guó)DDD家系行全基因組掃描，將該病的致病基因定位于17p13.3。該區(qū)域包含21個(gè)已知基因和16個(gè)預(yù)測(cè)基因，至今該區(qū)域的致病基因尚未克隆出。這說(shuō)明DDD具有一定的遺傳異質(zhì)性。
　　目的：對(duì)1個(gè)中國(guó)屈側(cè)網(wǎng)狀色素異常癥家系（家系Ⅰ）進(jìn)行全基因組連鎖和全基因組外顯子測(cè)序分析，經(jīng)過(guò)逐步的濾過(guò)和與家系Ⅰ無(wú)血緣關(guān)系的 DDD樣本的驗(yàn)證，篩選出該病的致病基因。
　　方法：(1)經(jīng)過(guò)嚴(yán)格篩查，2個(gè)DDD家系和1個(gè)DDD

4、散發(fā)患者納入了本次研究。對(duì)參加初篩的 DDD家系進(jìn)行全基因組分型，本次所采用的芯片為Illumina-660W-Beadchips。應(yīng)用Merlin軟件進(jìn)行連鎖分析，根據(jù)LOD值確定候選區(qū)域，然后進(jìn)行單倍型共分離，確定表型與染色體共分離的區(qū)域。（2）利用Genome AnalyzerⅡx對(duì)該家系的成員進(jìn)行全基因組外顯子捕獲。（3）注釋所有檢測(cè)到的變異體的功能，分類(lèi)為無(wú)義突變（nonsense mutation）、錯(cuò)義突變(missens

5、e mutation)、編碼區(qū)插入或缺失突變（coding indels，I)、同義突變（samesense mutation）、剪切位點(diǎn)突變（splice acceptor and donor site，SS)和非編碼區(qū)突變（Non-coding region mutation）等，篩選出可能影響基因功能的突變，如編碼區(qū)插入或缺失、非同義突變（nonsysnonymous，NS)、剪切位點(diǎn)突變。在可得的公共數(shù)據(jù)庫(kù)中(HapMap外顯子

6、組、dbSNP129,和千人基因組變異體數(shù)據(jù)庫(kù))過(guò)濾2個(gè)DDD患者的可影響基因功能的突變，再與2個(gè)對(duì)照者的分析結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。2個(gè)患者共有的，2個(gè)對(duì)照者沒(méi)有的，公共數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有的變異體即為候選變異體。
　　進(jìn)一步評(píng)估上述的候選變異體對(duì)基因功能的影響，結(jié)合連鎖分析所定位的染色體區(qū)域，進(jìn)而篩選出DDD可能的候選致病基因。(4)對(duì)初篩家系的候選致病基因行Sanger測(cè)序，篩選出表型共傳遞的變異體。(5)通過(guò)Sanger測(cè)序在其他家系的患者

7、和散發(fā)患者中檢驗(yàn)候選致病基因。之后，對(duì)大樣本的對(duì)照者的該基因進(jìn)行分析，排除多態(tài)性。
　　結(jié)果：(1)本課題組對(duì) DDD家系Ⅰ應(yīng)用全基因組連鎖分析(Genome-wide linkage analysis)方法將LOD值=1.5的表型與染色體共分離的區(qū)域定位在染色體20:17,722,478-36,009,145。(2)對(duì)全基因組外顯子測(cè)序結(jié)果進(jìn)行對(duì)比、過(guò)濾等分析發(fā)現(xiàn)，患者共有，而對(duì)照者、公共數(shù)據(jù)庫(kù)未攜帶的突變位點(diǎn)為42個(gè)，其中突變

8、點(diǎn)（c.246+5delG）位于連鎖分析定位的候選區(qū)域內(nèi)的POFUT1基因上。(3)進(jìn)一步對(duì)家系I中的5名患者和8名正常人的POFUT1進(jìn)行Sanger測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所用患者和1個(gè)12歲的男孩（該家系的發(fā)病年齡為20歲左右）攜帶突變位點(diǎn)POFUT1（c.246+5delG）,家系內(nèi)所有對(duì)照和100名正常人均不攜帶該突變。其余1個(gè)家系和1個(gè)散發(fā)患者沒(méi)有在POFUT1上發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。
　　結(jié)論：（1）本研究通過(guò)全基因組連鎖分析和全基因