基于全基因組外顯子測(cè)序技術(shù)進(jìn)行散發(fā)性結(jié)直腸癌候選基因DDI2的功能實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展以及生活習(xí)慣的改變，散發(fā)性結(jié)直腸癌(sporadic colorectal cancer，sCRC)的發(fā)病和死亡人數(shù)也在不斷上升，目前已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康的一類惡性腫瘤。根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)KRAS、P16和TP53等基因發(fā)生改變與結(jié)直腸癌的發(fā)生息息相關(guān)，但仍有30％的結(jié)直腸癌不是由此機(jī)制導(dǎo)致的，因此，探索部分腫瘤中新的發(fā)生機(jī)制及結(jié)直腸癌候選基因有重要意義。全基因組外顯子測(cè)序是一種具有高靈敏性的基因組分析

2、方法，它只需要通過對(duì)基因組中1％的序列測(cè)序就可以發(fā)現(xiàn)大量的疾病相關(guān)變異。
　　目的:
　　本課題通過全基因組外顯子測(cè)序篩選出散發(fā)性結(jié)直腸癌的可能的候選基因DDI2(DNA-damage inducible1homolog2)，并選擇LoVo細(xì)胞進(jìn)行體外基因過表達(dá)功能實(shí)驗(yàn)，為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。
　　方法:
　　首先利用全基因組外顯子測(cè)序技術(shù)篩選出三例sCRC癌組織樣本中特異的功能缺失(Loss of Functio

3、n,LoF)突變基因，結(jié)合相關(guān)生物信息分析方法確定散發(fā)性結(jié)直腸癌候選基因DDI2。之后，根據(jù)前期研究結(jié)果，選擇該基因表達(dá)水平最低的結(jié)直腸癌細(xì)胞LoVo，分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pIRES2-EGFP，質(zhì)粒pIRES2-DDI2，質(zhì)粒pIRES2-DDI2mutant后，進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察DDI2過表達(dá)對(duì)CRC細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響。
　　結(jié)果:
　　1)通過劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、CCK-8增殖

4、實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DDI2野生組與轉(zhuǎn)染對(duì)應(yīng)載體的對(duì)照組相比，結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo的遷移能力、侵襲能力、增殖能力均有一定的減弱，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　2)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，DDI2野生組與對(duì)照組相比，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞的凋亡比率有顯著性差異，這說明DDI2對(duì)于LoVo細(xì)胞增殖能力的影響可能并不是通過細(xì)胞凋亡引起的。
　　3)通過CCK-8檢測(cè)5-FU在不同濃度時(shí)的細(xì)胞活性情況，發(fā)現(xiàn)DDI