‘天源紅’獼猴桃授粉受精生理特性及其相關(guān)差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、本研究主要以全紅型軟棗獼猴桃品種‘天源紅’為試材，通過田間調(diào)查、石蠟切片等技術(shù)來探討影響‘天源紅’落果率相對(duì)較高的原因。同時(shí)，采用焦銻酸鹽沉淀法研究了獼猴桃有性生殖過程中的花粉管生長機(jī)理。應(yīng)用熒光顯微鏡、石蠟切片技術(shù)、差異凝膠電泳(DIGE)、質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF)和生物信息學(xué)技術(shù)，對(duì)其授粉、受精前后花柱和子房蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較研究，以期尋找授粉、受精時(shí)花柱及子房中特異表達(dá)的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步研究了獼猴桃有性生殖過程中授粉受精的分

2、子機(jī)理。主要結(jié)果如下:
　　1.對(duì)全紅型軟棗獼猴桃‘天源紅’花器結(jié)構(gòu)、雌花開放動(dòng)態(tài)及壽命、花期溫度、柱頭可授性、有效授粉期、授粉受精、胚胎發(fā)育、果實(shí)生長速率、落果率等進(jìn)行了系統(tǒng)研究。
　　(1)柱頭屬于干性柱頭，具有一道淺裂溝，乳突呈長圓柱形;開花過程可分為以下五個(gè)階段:花萼開裂期、花萼大裂期、花瓣變色期、大蕾期、開花期;整個(gè)開花過程溫度平穩(wěn)，開花整齊，雌花單花期為1～2d;柱頭可授性在花后1～2d最強(qiáng)，花開后3～5d可授性

3、逐漸降低，花后第6d喪失可授性;有效授粉期為開花第1d和第2d。
　　(2)受精作用屬于有絲分裂前配子融合類型。一個(gè)精子與卵細(xì)胞融合形成合子;另一個(gè)精子與次生極核融合形成初生胚乳核。
　　(3)胚發(fā)育屬茄型。卵細(xì)胞受精后，合子經(jīng)過3d左右的休眠期進(jìn)行第一次分裂。合子分裂通常發(fā)生在初生胚乳核分裂之后，經(jīng)棒形胚、球形胚、魚雷形胚和心形胚，至果實(shí)成熟時(shí)發(fā)育為子葉形胚。小球胚時(shí)期胚柄最為發(fā)達(dá)，球形胚末期胚柄開始退化，心形胚時(shí)期胚柄解

4、體。
　　(4)胚乳發(fā)育類型為細(xì)胞型。初生胚乳核先于合子分裂，胚乳細(xì)胞分裂較快，胚周圍的胚乳細(xì)胞有降解現(xiàn)象。至胚成熟形成種子時(shí)，胚乳細(xì)胞始終分布在種皮內(nèi)側(cè)周圍，因此‘天源紅’屬于有胚乳種子。
　　(5)花期、有效授粉期以及柱頭可授性時(shí)間短，同一子房受精不同步，胚囊、胚胎發(fā)育異常，這是‘天源紅’落果率相對(duì)較高的主要原因。
　　2.應(yīng)用掃描電鏡和熒光顯微鏡對(duì)‘天源紅’同種花粉在柱頭上原位萌發(fā)及花粉管生長情況進(jìn)行了觀察，并用

5、焦銻酸鹽沉淀法對(duì)其授粉前后柱頭及花柱中Ca2+進(jìn)行超微細(xì)胞化學(xué)定位，研究結(jié)果表明:
　　(1)授粉后1h，花粉管生長穿過柱頭表面，授粉后10h，生長到達(dá)花柱底部。
　　(2)授粉前后，柱頭接受面靠近柱頭外圍細(xì)胞的角質(zhì)層一側(cè)細(xì)胞器內(nèi)含有豐富的鈣，而柱頭非接受表面鈣顆粒分布很少。
　　(3)授粉前和授粉后1h，花柱頂端鈣顆粒較少，基部鈣顆粒較多;授粉后10h，花柱頂端和基部鈣分布密度無明顯差別。
　　(4)授粉前后花

6、柱頂端鈣主要均勻分布在細(xì)胞質(zhì)膜位置;在花柱基部授粉前主要在引導(dǎo)組織胞間隙中，授粉后1h主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，授粉后10h主要存在于細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。獼猴桃授粉前后，柱頭和花柱組織中均含有鈣，授粉前和授粉后1h花柱中的鈣呈現(xiàn)出梯度分布，授粉后10h鈣的梯度分布現(xiàn)象減弱甚至消失。
　　3.應(yīng)用熒光顯微鏡、石蠟切片技術(shù)、差異凝膠電泳(DIGE)、質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF)和生物信息學(xué)技術(shù)，對(duì)其授粉、受精前后花柱和子房蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較研

7、究。
　　(1)采用DIGE進(jìn)行分離后，成功獲得了蛋白質(zhì)組分辨率高、蛋白點(diǎn)數(shù)多、分布均勻且清晰的花柱、子房雙向凝膠電泳圖譜。
　　(2)DeCyderV6.5軟件分析獲得授粉前后花柱差異2.5倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)共有24個(gè)，質(zhì)譜鑒定成功了18個(gè)點(diǎn)，其中有8個(gè)差異蛋白點(diǎn)屬于actinidin家族的蛋白，另有兩個(gè)差異點(diǎn)屬于同一種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)主要與水解、細(xì)胞壁代謝、逆境脅迫響應(yīng)、糖類和能量代謝等有關(guān);10個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的表達(dá)差

8、異蛋白點(diǎn)，其中5個(gè)在花柱中表達(dá)上調(diào)，5個(gè)表達(dá)下調(diào)。根據(jù)獼猴桃授粉前后花柱差異蛋白表達(dá)譜比較，篩選出與授粉相關(guān)的花柱蛋白。
　　(3)用DIGE進(jìn)行分離并用DeCyderV6.5軟件分析，在授粉前、授粉后120h的子房中共檢測(cè)到約1500個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中有55個(gè)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn);質(zhì)譜鑒定了差異2.0倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)13個(gè)，得到了8個(gè)鑒定結(jié)果，分別屬于6種蛋白質(zhì);6種差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中5種在授粉后子房中表達(dá)上調(diào)，只有1種表達(dá)下調(diào)。根據(jù)