福建牡蠣(Crassostrea angutala)生長(zhǎng)相關(guān)基因和群體選育研究.pdf

1、福建牡蠣(Crassostreaangulata)舊稱(chēng)僧帽牡蠣，是福建的重要養(yǎng)殖貝類(lèi)。《2011年農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局》的數(shù)據(jù)顯示，2010年福建省牡蠣養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)1，456，106噸，占全國(guó)的40％，居全國(guó)首位，其中主要養(yǎng)殖品種為福建牡蠣。本論文對(duì)福建牡蠣生長(zhǎng)相關(guān)基因和群體選育進(jìn)行了研究，擬對(duì)福建牡蠣生長(zhǎng)相關(guān)基因做深一步的了解，同時(shí)進(jìn)行了福建牡蠣群體選育，有望為福建牡蠣良種選育提供理論支持。
　　 本研究采用SSH、454/Roche轉(zhuǎn)

2、錄組文庫(kù)方法，建立牡蠣早期發(fā)育不同階段cDNA文庫(kù)。SSH文庫(kù)隨機(jī)調(diào)取672個(gè)克隆，送交上海生工測(cè)序。獲得序列653條，測(cè)序成功率97.2％，將其數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，得到Unigenes(contigs+singlets)553條，重復(fù)序列占測(cè)序成功序列15.3％。CAP3除去重復(fù)和小于100的低質(zhì)量EST，得到有效EST553條，平均長(zhǎng)度600bp，其中54個(gè)重疊組是由兩條EST拼接而成，9條是3條EST拼接而成，3條是由4條或4條以上ES

3、T拼接而成的。非冗余序列占全部有效測(cè)序序列的71.51％。
　　 454/Roche轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)共得到566917條EST，平均長(zhǎng)度319bp。牡蠣發(fā)育的8個(gè)時(shí)期通過(guò)添加不同的物理標(biāo)簽用以區(qū)分，去除接頭和小于60bp的短片段之后，剩余555215條序列，共173Mb，平均長(zhǎng)度309bp。對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接得到了10462條contig，112366條singleton。Contigs平均長(zhǎng)度723bp，singleton平均長(zhǎng)度2

4、75bp，6878條contig長(zhǎng)度超過(guò)500bp，1907條contig長(zhǎng)度超過(guò)lkb。所有基因最后可以Mapping到262個(gè)Pathway通路上，其中Pathway包含了生長(zhǎng)、代謝、發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞膜離子泵等。基因波動(dòng)最大的30條基因中有10條基因完全不能和genebank中的序列配對(duì)，說(shuō)明雙殼貝類(lèi)可能在發(fā)育、生長(zhǎng)、變態(tài)中具有獨(dú)特的分子機(jī)制。
　　 對(duì)454轉(zhuǎn)錄組中的IGF-like基因應(yīng)用RNAi、定量PCR、免疫組

5、化等方法進(jìn)行了功能驗(yàn)證，其中RNAi干擾后的牡蠣生長(zhǎng)速率顯著比對(duì)照變慢，同時(shí)，干擾后的牡蠣其IGF在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均下降。通過(guò)T7展示文庫(kù)，淘選了一批和牡蠣I(yíng)GF相結(jié)合的EST，根據(jù)EST序列，通過(guò)RACE實(shí)驗(yàn)，克隆了和牡蠣I(yíng)GF相關(guān)的基因11條，分別是:細(xì)胞凋亡蛋白，DAP(death-associatedprotein);氯離子通路基因，CIC(Chlorideintracelluarchannel);福建牡蠣細(xì)胞凋亡基因，Gadd

6、a(growtharrestandDNA-damage-inducible，alpha);生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子，RAs(RASdomainsubfamilybZIP);福建牡蠣同源基因，HOX(HOX12proteinisoform3);低密度脂肪受體，LDLtor(Low-densitylipoproteinreceptor);類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子受體基因，IGFR(Insulin-likegrowthfactorreceptor)。
　　

7、 針對(duì)牡蠣生長(zhǎng)性狀進(jìn)行了群體選育，2009年6月，本研究進(jìn)行了漳浦北江養(yǎng)殖群體為親本的群體選育，選育目標(biāo)為生長(zhǎng)快速性狀。2010年9月和2011年11月分別進(jìn)行了以生長(zhǎng)快速為目標(biāo)的第二代和第三代選育，選育效果顯著，在90天日齡時(shí)，第三代選育組總濕重比對(duì)照組增加27.93％，差異顯著(P＜0.01)。對(duì)選育三代群體進(jìn)行遺傳分析學(xué)分析，結(jié)果表明盡管選育三代，但選育后代仍具有很高的基因多態(tài)性(PIC＞0.5)，沒(méi)有發(fā)生明顯的近交衰退(P＞0