福建牡蠣(Crassostrea angulata)生殖內(nèi)分泌研究.pdf

1、福建牡蠣(Crassostreaangulata)，又稱葡萄牙牡蠣，是我國南方貝類養(yǎng)殖的主要種類，并且近年來其商業(yè)價值不斷增加，對福建牡蠣生殖調(diào)控的研究在養(yǎng)殖中具有重要的應(yīng)用價值。此外，牡蠣是分析河口污染情況的環(huán)境指示種，養(yǎng)殖環(huán)境中大量的污染物可以通過擾亂牡蠣的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)影響牡蠣的生理活動，因此對牡蠣內(nèi)分泌機制的研究顯得格外重要。然而目前國內(nèi)外有關(guān)貝類生殖內(nèi)分泌的研究卻十分有限。本文通過分子生物學(xué)和生物化學(xué)方法對福建牡蠣的性類固醇激素、

2、類固醇合成酶、類固醇激素受體和類固醇生成因子進(jìn)行了相關(guān)研究，并比較了三倍體和二倍體福建牡蠣生殖內(nèi)分泌方面的差異。主要結(jié)果如下:
　　 1.性類固醇激素在福建牡蠣性腺發(fā)育中的作用
　　 福建牡蠣卵巢和精巢中雌二醇和睪酮的含量分別為95.97～280.98pg/g、16.06～30.09pg/g，并且雌二醇在卵巢中含量更高(P＜0.05)，睪酮在精巢中含量更高(P＜0.05)。這兩種激素的含量分別隨著牡蠣卵巢和精巢的發(fā)育逐漸

3、增加，但在配子排放后顯著下降(P＜0.05)。用一定濃度的雌二醇對性腺發(fā)育早期的福建牡蠣進(jìn)行活體浸泡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雌二醇對牡蠣卵黃蛋白原基因的表達(dá)具有顯著的誘導(dǎo)效果(P＜0.05）?？偟膩碚f，雌二醇和睪酮的含量變化與福建牡蠣的生殖周期密切相關(guān)，在福建牡蠣的性腺發(fā)育和成熟過程中發(fā)揮了重要作用。
　　 2.福建牡蠣性類固醇激素的合成機制
　　 克隆獲得了福建牡蠣三個類固醇合成酶3β-HSD、17β-HSD和Cyp17基因的cDN

4、A全長，它們?nèi)L分別為1444、1149、2098bp，各自編碼356、307、250個氨基酸。這三個基因在牡蠣大多數(shù)組織中均有表達(dá)，但在性腺中表達(dá)量最高(P＜0.05)。牡蠣性腺中3β-HSD和Cyp17基因的表達(dá)量從增殖期到成熟期逐漸升高，而在配子排放后急劇降低（P＜0.05）。相反，在性腺成熟過程中17β-HSD基因的表達(dá)量較低，而在發(fā)育前和排放后其表達(dá)量較高(P＜0.05）。生殖周期中3β-HSD、17β-HSD和Cyp17基因

5、的表達(dá)模式與牡蠣性腺中雌二醇和睪酮水平變化呈較好的相關(guān)性。原位雜交結(jié)果顯示這三個基因均表達(dá)在卵巢的濾泡細(xì)胞中。此外，利用透射電鏡技術(shù)觀察到福建牡蠣性腺的濾泡細(xì)胞中含有大量的線粒體、發(fā)達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、散落的糖原顆粒和脂滴，細(xì)胞表面還具有微絨毛結(jié)構(gòu)，顯示出內(nèi)分泌細(xì)胞的典型特征。因此結(jié)合原位雜交和透射電鏡的結(jié)果，我們推測濾泡細(xì)胞是福建牡蠣性腺中的內(nèi)分泌細(xì)胞。
　　 3.福建牡蠣性類固醇激素的作用機制
　　 獲得了福建牡蠣一個編碼7

6、44個氨基酸的雌激素受體基因，全長3161bp，它與其他貝類雌激素受體的氨基酸序列相似性超過60％。雌激素受體基因在福建牡蠣卵巢中高表達(dá)(P＜0.05)，并主要表達(dá)在卵巢的濾泡細(xì)胞中。與雌二醇含量在福建牡蠣性腺不同發(fā)育階段的變化趨勢相似，雌激素受體基因的表達(dá)量從增殖期開始逐步上升，在成熟期達(dá)到最高值(P＜0.05），而排卵后又快速回落(P＜0.05)。而整個生殖周期中，牡蠣精巢中雌激素受體基因的表達(dá)量一直維持在較低水平。當(dāng)向性腺中注射雌

7、激素受體dsRNA后，研究發(fā)現(xiàn)牡蠣性腺卵黃蛋白原基因的表達(dá)受到抑制，配子發(fā)育明顯受阻，這表明雌激素受體可能參與了性類固醇激素對牡蠣性腺發(fā)育的調(diào)控。
　　 4.福建牡蠣的類固醇生成因子
　　 克隆獲得了福建牡蠣一個孤兒核受體基因FTZ-F1，其cDNA全長2357bp，共編碼530個氨基酸。福建牡蠣FTZ-F1的氨基酸序列與其他物種具有較高的相似性，尤其在DNA結(jié)合區(qū)(＞90％)和配體結(jié)合區(qū)(＞44％)。福建牡蠣卵巢中FT

8、Z-F1基因的表達(dá)量最高，且生長期和成熟期的表達(dá)量分別高達(dá)排放期的153和54倍(P＜0.05）。FTZ-F1基因主要表達(dá)在牡蠣卵細(xì)胞周邊的濾泡細(xì)胞中。當(dāng)用RNAi的方法抑制牡蠣FTZ-F1基因的表達(dá)后，性腺中3β-HSD、Cyp17、Follistatin基因的表達(dá)量下降，雌二醇和睪酮的含量降低，性腺發(fā)育遲緩。因此，我們推測FTZ-F1作為類固醇生成因子參與了牡蠣體內(nèi)類固醇激素的合成調(diào)節(jié)。
　　 5.三倍體和二倍體福建牡蠣生殖

9、內(nèi)分泌的差異
　　 經(jīng)過10個月的海區(qū)養(yǎng)殖之后，三倍體福建牡蠣殼高、總重、閉殼肌重分別高出二倍體10％、29.6％和40％。但是三倍體牡蠣的性腺發(fā)育受到抑制，僅發(fā)現(xiàn)27％的個體發(fā)育出明顯的精巢和卵巢。在生殖內(nèi)分泌方面，三倍體福建牡蠣的性類固醇激素水平及內(nèi)分泌相關(guān)基因（包括Vg、3β-HSD、Cyp17、FTZ-F1和Follistatin)的表達(dá)量也較二倍體有所降低?？梢?，三倍體牡蠣育性差可能與生殖內(nèi)分泌調(diào)節(jié)受到抑制有密切關(guān)系。