星鰈生殖生理和內(nèi)分泌特征研究.pdf

1、本文以我國(guó)重要海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚種一星鰈為研究對(duì)象,以建立穩(wěn)定的星鰈人工繁育技術(shù)體系為研究目的,以腦垂體、性腺發(fā)育規(guī)律、性類固醇激素表達(dá)、配子發(fā)育成熟、GnRH克隆表達(dá)為研究核心和主線,綜合運(yùn)用組織學(xué)、電鏡技術(shù)、組織化學(xué)、放射免疫技術(shù)、分子克隆技術(shù)、基因定量表達(dá)和激素誘導(dǎo)技術(shù)等方法,全面認(rèn)識(shí)了星鰈生殖生理和內(nèi)分泌特征。以此為參考,在生產(chǎn)實(shí)踐中成功誘導(dǎo)星鰈親魚性腺成熟產(chǎn)卵,為建立穩(wěn)定的星鰈人工繁育技術(shù)提供了參考依據(jù)和技術(shù)支持。附錄部分,將本人

2、2009-2010年在美國(guó)聯(lián)合研究期間的相關(guān)研究?jī)?nèi)容和結(jié)果做了簡(jiǎn)要概述。本文各部分研究結(jié)果簡(jiǎn)述如下:
　　 首次系統(tǒng)研究和認(rèn)識(shí)了星鰈親魚卵巢發(fā)育規(guī)律、性類固醇激素表達(dá)與溫光調(diào)控的關(guān)系。星鰈卵巢發(fā)育屬非同步分批發(fā)育模式,一年一次成熟分批產(chǎn)卵類型。卵巢年周期發(fā)育過(guò)程中可見5個(gè)發(fā)育時(shí)相的卵母細(xì)胞,卵巢發(fā)育相應(yīng)劃分為5個(gè)發(fā)育時(shí)期。性腺指數(shù)(GSI)、肝臟指數(shù)(HIS)和肥滿度(CF)在親魚的年周期發(fā)育中呈現(xiàn)規(guī)律性的變化。血漿性類固醇激素

3、水平呈現(xiàn)周期性變化,并與性腺成熟周期具有密切的藕聯(lián)關(guān)系。水溫和光周期對(duì)卵巢發(fā)育具有明顯的影響并顯著影響性類固醇激素的表達(dá)。圓斑星鰈和條斑星鰈卵巢發(fā)育的有效積溫分別為1050日.度和1180日.度,研究結(jié)果可為親魚促熟和激素催產(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)。首次研究了外源激素sGnRH、LHRHa對(duì)2齡雌性圓斑星鰈后備親魚性腺發(fā)育的誘導(dǎo)效果:2齡親魚對(duì)外源激素的誘導(dǎo)應(yīng)答效應(yīng)較性成熟親魚弱,卵母細(xì)胞發(fā)育可達(dá)到5時(shí)相早中期但未能達(dá)到水合成熟,性類固醇激素表達(dá)

4、水平顯著升高,但未能引發(fā)排卵。
　　 探明了星鰈精巢年周期發(fā)育的生理和內(nèi)分泌特征:精巢年周期發(fā)育過(guò)程中可見5個(gè)時(shí)相的生殖細(xì)胞,精巢發(fā)育相應(yīng)分為5期。研究中首次發(fā)現(xiàn)圓斑星鰈雄魚存在雌雄同體現(xiàn)象,但機(jī)制不明。認(rèn)識(shí)了星鰈精巢年周期發(fā)育過(guò)程的性類固醇激素表達(dá)變化規(guī)律。圓斑星鰈和條斑星鰈精子具有相似的共同結(jié)構(gòu),都具有頭部、中段和鞭毛3部分,其結(jié)構(gòu)與其它高等魚類精子結(jié)構(gòu)相似。精子不具頂體,但具有開口于核前端稍偏處呈不規(guī)則狀的核前部凹陷及核內(nèi)

5、核泡。圓斑星鰈精子活力最適宜溫度8-12℃,最適宜鹽度25-35,最適宜pH7-8。超低溫冷凍保存了圓斑星鰈精子,以12％GLY+10％YK及12％MeOH+10％YK保存精子的效果較好,解凍后受精率和孵化率較高,與新鮮精液無(wú)顯著差異。外源激素GnRH和HCG處理都可以顯著提高條斑星鰈精液質(zhì)量,精液流動(dòng)性和液化能力增強(qiáng)、精子活動(dòng)率和快速活動(dòng)率顯著提高、快速活動(dòng)時(shí)間和精子壽命延長(zhǎng),性類固醇激素表達(dá)水平明顯升高,表明緩釋激素誘導(dǎo)可有效提升條

6、斑星鰈雄魚的精液質(zhì)量。
　　 首次觀察了條斑星鰈腦垂體組織和超微結(jié)構(gòu):腦垂體呈背腹型,包括神經(jīng)垂體和腺垂體兩部分。神經(jīng)垂體為一束神經(jīng)纖維,中間夾雜兩種垂體細(xì)胞和有兩種不同的膠質(zhì)。腺垂體分為前腺垂體(RPD)、中腺垂體(PPD)和后腺垂體(PI)。腺垂體內(nèi)鑒別出6種內(nèi)分泌細(xì)胞。前腺垂體表達(dá)3種,中腺垂體表達(dá)3種,后腺垂體表達(dá)1種。以半滑舌鰨為研究載體,首次闡明了性類固醇激素17β-雌二醇(E2)及其受體(ERα)、睪酮受體(AR)

7、在性腺分化發(fā)育過(guò)程中的免疫細(xì)胞化學(xué)定位和可能的生理功能:原始性腺中已有E2、ERα和AR的分布和表達(dá);不同發(fā)育時(shí)期的配子細(xì)胞對(duì)E2及ERα、AR抗體均呈現(xiàn)不同程度的陽(yáng)性或陰性反應(yīng),為性類固醇激素參與鲆鰈類性腺分化提供了重要的形態(tài)學(xué)證據(jù)。
　　 采用分子克隆技術(shù),首次系統(tǒng)研究了圓斑星鰈GnRH信號(hào)系統(tǒng)及其可能的生理功能。在圓斑星鰈腦中克隆到3種GnRH基因,分別是:cGnRH-Ⅱ、sGnRH和sbGnRH。每一種GnRH都包括一個(gè)

8、信號(hào)肽、一個(gè)Gly-Lys-Arg連接序列和一個(gè)GnRH相關(guān)肽。分析了3種GnRH基因的氨基酸序列與其它脊椎動(dòng)物的同源性。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明圓斑星鰈3種不同分子形式的GnRH分別歸屬于3個(gè)不同分支:cGnRH-Ⅱ分支、sGnRH分支和魚類特異性GnRH分支(如sbGnRH、cfGnRH等)。GnRH基因都在腦中表現(xiàn)出最高表達(dá)水平且具有性別特異性表達(dá)模式:雌性中不同組織的GnRH mRNA表達(dá)水平都相應(yīng)高于雄性。cGnRH-Ⅱ的mRNA僅在