GH-IGF軸相關(guān)基因在不同倍性鯽鯉中的表達(dá)及生長(zhǎng)的相關(guān)性研究.pdf

1、異源四倍體鯽鯉是紅鯽(Carassius auratus red var，♀)和湘江野鯉(Cyprinus carpio，♂)遠(yuǎn)源雜交獲得的后代，是世界上首次獲得的兩性可育、遺傳性狀穩(wěn)定的多倍體群體。用雄性異源四倍體鯽鯉與雌性二倍體日本白鯽(Carassius auratus Cuvieri)交配產(chǎn)生了不育的三倍體湘云鯽。三倍體湘云鯽具有多種優(yōu)勢(shì)，如性腺不育、生長(zhǎng)速度快、肉質(zhì)鮮美、抗病能力強(qiáng)。異源四倍體鯽鯉和三倍體湘云鯽的獲得為不同倍性

2、魚生物學(xué)的比較研究提供了重要的生物學(xué)平臺(tái)。
　　 魚類的生長(zhǎng)是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的生理過程，受到眾多激素的調(diào)節(jié)。其中GH/IGF軸在魚類的生長(zhǎng)調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。GH/IGF軸主要包括有生長(zhǎng)激素(GH)、生長(zhǎng)激素受體(GHR)和胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)。GH通過與靶細(xì)胞膜表面的GHR結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，促進(jìn)IGF-1的表達(dá)。IGF-1通過血液循環(huán)到達(dá)機(jī)體組織，促進(jìn)組織細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。本研究首次系統(tǒng)地分析了二倍體紅鯽

3、，三倍體湘云鯽和異源四倍體鯽鯉的GH/IGF軸相關(guān)基因的表達(dá)情況，為三倍體湘云鯽的快速生長(zhǎng)提供了重要的內(nèi)分泌調(diào)控機(jī)制的分子生物學(xué)證據(jù)。本研究的主要內(nèi)容如下：
　　 1)采用PCR擴(kuò)增的方法，克隆得到了不同倍性魚的GH、GHR和IGF-1基因的cDNA序列。所得到的GH、GHR和IGF-1的氨基酸序列均含有其保守的結(jié)構(gòu)，如保守的半胱氨酸殘基，N-糖基化位點(diǎn)等。序列比對(duì)結(jié)果顯示，所得到的相關(guān)基因的序列與魚類有較高的相似性，而與哺乳動(dòng)

4、物的相似性較低。構(gòu)建的進(jìn)化樹也顯示出與魚類的高度相似性。這些結(jié)果表明，GH、GHR以及IGF-1基因在進(jìn)化過程中是相對(duì)保守的。
　　 2)比較研究了GH、GHR和IGF-1基因在不同倍性鯽鯉中的表達(dá)情況。研究結(jié)果表明GH只在垂體中特異表達(dá)，而GHR和IGF-1是廣泛性表達(dá)的基因，在研究的各個(gè)組織中均有表達(dá)，并且肝臟中的表達(dá)量最高。在繁殖季節(jié)和非繁殖季節(jié)，垂體中的GH、肝臟中的GHR，肝臟和肌肉中的IGF-1在三倍體湘云鯽的表達(dá)量

5、顯著地高于二倍體紅鯽和異源四倍體鯽鯉。GH/IGF軸相關(guān)基因在三倍體湘云鯽中的高表達(dá)可能是其快速生長(zhǎng)的原因之一。
　　 3)分析了GH/IGF軸相關(guān)基因在不同溫度和營(yíng)養(yǎng)條件下在不同倍性鯽鯉中的表達(dá)情況。在不同倍性鯽鯉中，在各個(gè)溫度梯度下，三倍體湘云鯽中的表達(dá)量均顯著高于二倍體紅鯽的表達(dá)量。但在同一種魚中，不同的溫度對(duì)于GH、GHR和IGF-1的表達(dá)影響不大，各個(gè)基因的表達(dá)沒有顯著的變化。處于禁食狀態(tài)下的實(shí)驗(yàn)魚，GH、GHR和IG

6、F-1的表達(dá)量比喂食狀態(tài)下的表達(dá)量低。但不管在禁食狀態(tài)還是喂食狀態(tài)下，三倍體湘云鯽中的表達(dá)量均高于二倍體紅鯽的表達(dá)量。這些結(jié)果說明，三倍體湘云鯽GH/IGF軸相關(guān)基因的高表達(dá)并不是由環(huán)境因素引起的，而是由自身的遺傳特征導(dǎo)致的。
　　 4)應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組織化學(xué)分析了IGF-1基因在不同倍性鯽鯉卵巢中的表達(dá)和定位分析，并研究了hCG和E2對(duì)卵巢和肝臟中IGF-1基因的調(diào)控作用。研究結(jié)果表明，三倍體湘云鯽卵巢中的IGF

7、-1mRNA在繁殖季節(jié)和非繁殖季節(jié)中的表達(dá)量均高于二倍體紅鯽和異源四倍體鯽鯉的表達(dá)量。免疫組織化學(xué)的結(jié)果顯示，IGF-1蛋白表達(dá)于早期卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、濾泡細(xì)胞和成熟卵母細(xì)胞的放射膜的外層細(xì)胞。體內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)證明，hCG和E2能夠抑制卵巢和肝臟中IGF-1的表達(dá)。這些結(jié)果說明三倍體湘云鯽HPG軸基因表達(dá)紊亂，不能激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而不能正常抑制IGF-1的表達(dá)，導(dǎo)致了三倍體湘云鯽卵巢和肝臟中的IGF-1表達(dá)的上升。
　　

8、 5)采用RT-PCR方法，克隆得到了不同倍性鯽鯉的IGF-2基因，并對(duì)IGF-2在不同倍性鯽鯉中的表達(dá)進(jìn)行了分析。研究結(jié)果表明所得到的IGF-2基因均含有保守的半胱氨酸殘基；序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)所得到的IGF-2基因與鯉科魚類的IGF-2基因有較高的相似性，而與哺乳動(dòng)物的相似性較低。IGF-2是廣泛性表達(dá)的基因，在各個(gè)組織中均有表達(dá)，并且在肝臟中的表達(dá)量最高。在繁殖季節(jié)，三倍體湘云鯽的表達(dá)量高于二倍體紅鯽和異源四倍體鯽鯉，而在非繁殖季節(jié)，IG

9、F-2基因的表達(dá)在三種魚之間沒有顯著的差異性，說明IGF-2基因與在三倍體湘云鯽的快速生長(zhǎng)有著正相關(guān)性。
　　 綜上所述，三倍體湘云鯽垂體中高比例的STH細(xì)胞，導(dǎo)致垂體中GH的表達(dá)量上升，從而導(dǎo)致肝臟中GHR的表達(dá)量上升，最終導(dǎo)致肝臟和肌肉中的IGF-1基因的高表達(dá)，促進(jìn)了三倍體的快速生長(zhǎng)；另外，三倍體湘云鯽HPG軸相關(guān)基因表達(dá)紊亂，不能激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而不能正常抑制IGF-1的表達(dá)，導(dǎo)致IGF-1表達(dá)的上升，可能導(dǎo)致