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文檔簡介
1、西羅血紅素是最簡單的功能四吡咯分子,它作為亞硝酸還原酶和亞硫酸還原酶的輔基,參與植物N和S的同化。西羅血紅素的合成發(fā)生在質體中,經過甲基化、氧化、鐵螯合三步反應。西羅葉綠三酸鐵螯合酶是西羅血紅素生物合成的關鍵酶,它是合成四吡咯分子的第二類螯合酶,它的活性不需要ATP參與。目前植物中僅有擬南芥西羅葉綠三酸鐵螯合酶(SirB)的相關研究,本文初步研究了玉米西羅葉綠三酸鐵螯合酶(ZmSFC)及其突變體ZmSFCM1、ZmSFCM2在大腸桿菌中
2、的重組表達和純化,并對ZmSFC及突變體ZmSFCM1的蛋白進行了光譜學和電子順磁共振分析,通過熒光定量PCR分析了不同濃度硝酸鹽或硫酸鹽處理后玉米葉片中ZmSFC基因的表達情況。獲得如下主要結果:
1.提取玉米B73自交系葉片的總RNA,以反轉錄的cDNA為模板擴增出編碼ZmSFC的成熟基因,插入pMF-Dute-1表達載體中,0.5mmol/L的IPTG,28℃誘導12h,Ni-NTA親和純化ZmSFC蛋白,SDS-P
3、AGE顯示純化的蛋白為一條主帶,亞基分子量大小約為18kDa。
2.設計引物定點突變ZmSFC蛋白,第一輪突變一個氨基酸殘基,獲得突變體ZmSFCM1(C60A),在第一輪的基礎上進行第二輪突變,獲得三個氨基酸殘基突變的突變體ZmSFCM2(C60A,E42I,P43A)。分別對這個兩個突變體進行蛋白的表達和純化,SDS-PAGE顯示純化的蛋白亞基分子量大小與原蛋白表達一致。
3.純化得到的ZmSFC和ZmS
4、FCM1蛋白進行光譜學分析,紫外可見光譜掃描顯示,在315nm、415nm和519nm處有三處吸收峰,這三處吸收峰均為蛋白中含有鐵硫簇的典型吸收峰,表明純化的ZmSFC和ZmSFCM1蛋白中含有Fe-S簇結構。電子順磁共振波譜表明純化的ZmSFC和ZmSFCM1均含有[2Fe-2S]結構。這表明第一個保守的半光氨酸殘基不參與Fe-S簇的形成。
4.將ZmSFCM1和ZmSFCM2蛋白濃度超濾至12mg/mL,母液為20mm
5、ol/LTris-HCl,100mmol/LNaCl,pH8.0。采用懸滴法,HamptonScreenⅠ&Ⅱ98種篩選條件,在10℃恒溫生長一周后,17號條件獲得微晶,為棒狀晶型。17號條件為:0.2M硫酸鋰,0.1MTris-HCl,pH8.5,30%PEG4000。
5.分別用不同濃度的硝酸鈉和硫酸鉀對玉米幼葉進行處理,25℃4h后,提取葉片總RNA,進行熒光定量PCR分析,結果表明:20mmol/L的NaNO3和5
6、0mmol/L的K2SO4處理后,玉米葉片中ZmSFC基因表達量最高。
綜上所述,本研究獲得了玉米編碼成熟ZmSFC的基因,獲得兩個突變體ZmSFCM1(C60A)和ZmSFCM2(C60A,E42I,P43A),分析了它們在大腸桿菌中的重組表達,親和純化獲得了蛋白,紫外可見光譜掃描和電子順磁共振波譜表明純化的蛋白中存在Fe-S簇結構,兩個突變體的蛋白進行晶體生長,初步獲得了微晶,熒光定量PCR表明低濃度的硝酸鈉或硫酸鉀處
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