水稻異分支酸合酶和水楊酸羥基化酶的鑒定與功能研究.pdf

1、水楊酸(Salicylic acid,SA)是一種廣泛存在于植物中的重要激素，可以直接或間接地調(diào)節(jié)植物的抗病反應(yīng)、葉片衰老等生命活動。不同植物中的SA含量差異很大。目前，模式植物擬南芥中SA的生物學功能、合成代謝和分解代謝研究地相對比較清楚，而單子葉植物水稻中SA相關(guān)的研究尚未取得很大的進展。
　　為了探索SA在水稻中的代謝機制，本文綜合運用分子生物學、生物化學、遺傳學、植物病理學等研究方法，開展對水稻異分支酸合酶、SA羥基化酶的

2、生物信息學分析和生物學功能研究，鑒定了異分支酸合酶OsICS1、SA羥基化酶OsS5H-1和OsS5H-2在SA代謝中的生物學功能，具體研究結(jié)果如下:
　　(1)生物信息學分析結(jié)果表明，候選基因OsICS1有異分支酸合成酶家族保守的結(jié)構(gòu)域;候選基因OsS5H-1、OsS5H-2均有2-酮戊二酸依賴性亞鐵加氧酶結(jié)構(gòu)域。
　　(2)利用酶活測定方法，以SA為底物測定了OsS5H-1和OsS5H-2羥基化酶的催化活性，均可以催化S

3、A的羥基化。
　　(3)利用擬南芥轉(zhuǎn)基因技術(shù)，成功獲得OsICS1、OsS5H-1、OsS5H-2的互補轉(zhuǎn)基因植株OsICS1-C-1、OsICS1-C-2;OsS5H-1-C-1、OsS5H-1-C-2、OsS5H-1-C-3;OsS5H-2-C-1、OsS5H-2-C-2。
　　(4)利用CRISPR Cas9技術(shù)和水稻轉(zhuǎn)基因方法，成功獲得了OsICS1的純合突變體ics1-1、ics1-2、ics1-3;OsS5H-1

4、的純合突變體s5h-1-1、s5h-1-2、s5h-1-3;OsS5H-2的純合突變體s5h-2-1、s5h-2-2;OsS5H-1的超表達轉(zhuǎn)基因植株OsS5H-1OE-1、OsS5H-1OE-2、OsS5H-1OE-3;OsS5H-2的超表達轉(zhuǎn)基因植株OsS5H-2OE-1、OsS5H-2OE-2。
　　(5)利用實時熒光定量技術(shù)，對相關(guān)基因的表達進行了分析。OsICS1和OsS5H-1在衰老的葉片中表達量高于幼嫩的葉片，而Os

5、S5H-2相反;OsICS1和OsS5H-2均不受SA誘導;OsS5H-1受SA誘導后，表達量增加了95％;ics1突變體中SA響應(yīng)基因PR1＃051和PR10a的表達量顯著低于日本晴。
　　(6)對轉(zhuǎn)基因后代的遺傳分析表明，OsICS1-C-1和OsICS1-C-2改變了atsid2(salicylic acid deficent2)延遲衰老的表型;ics1-1、ics1-2、ics1-3萌發(fā)15天后，表現(xiàn)出氧化脅迫病斑的性狀，

6、和SA缺失轉(zhuǎn)基因植株NahG表型相似;OsS5H-1-C-1、OsS5H-1-C-2、OsS5H-1-C-3、OsS5H-2-C-1、OsS5H-2-C-2改變了ats3hs5h瘦小和早衰的表型;s5h-1-1、s5h-1-2、s5h-1-3的株高低于日本晴，OsS5H-1OE-1、OsS5H-1OE-2、OsS5H-1OE-3的株高明顯高于日本晴;分蘗盛期接種白葉枯后，超表達轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)為增強的感病性，而s5h-1和s5h-2突變

7、體均未表現(xiàn)出增強的抗病性。
　　(7)對轉(zhuǎn)基因后代代謝分析表明，OsICS1-C-1和OsICS1-C-2中SA的含量顯著增加，改變了atsid2缺失SA的表型;OsS5H-1-C-1、OsS5H-1-C-2、OsS5H-1-C-3、OsS5H-2-C-1、OsS5H-2-C-2中SA的含量顯著降低，改變了SA過度積累的表型;15天的ics1-1、ics1-2、ics1-3突變體中SA的含量降低了67％，而在40天時，SA的含量沒