甘薯病毒病害(SPVD)病原的檢測(cè)方法和分子變異研究.pdf

1、甘薯病毒病害(Sweet potato virus disease，SPVD)是甘薯褪綠矮化病毒(Sweet potatochlorotic stunt virus，SPCSV)和甘薯羽狀斑駁病毒(Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV)協(xié)生共侵染甘薯引起的病毒病害。SPVD對(duì)甘薯產(chǎn)量影響極大，嚴(yán)重時(shí)可造成90％以上的產(chǎn)量損失，甚至絕收，是甘薯上的毀滅性病害。因此，建立一種簡便、快速、有效的檢測(cè)

2、SPVD的方法，對(duì)于該病的預(yù)警和防治具有重要意義。本研究探索了針對(duì)甘薯及傳毒煙粉虱中SPVD病原的檢測(cè)技術(shù)，并對(duì)我國甘薯上SPCSV的分子變異情況進(jìn)行了初步分析。獲得的主要結(jié)果如下：
　　 (1)根據(jù)SPCSV Hsp70基因和SPFMV CP基因核苷酸序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)了4對(duì)引物，以單一RT-PCR反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，分別對(duì)影響多重RT-PCR擴(kuò)增的退火溫度、Taq DNA聚合酶濃度、dNTPs濃度、Mg2+濃度、引物濃度等條件進(jìn)

3、行了優(yōu)化，建立了能同時(shí)檢測(cè)SPVD兩種病原的多重RT-PCR方法。該方法能有效區(qū)分SPFMV的主要株系類型。靈敏性試驗(yàn)表明，建立的多重RT-PCR方法對(duì)SPFMV-CH2、SPFMV-CH和SPCSV的最低檢測(cè)濃度分別為1.42×104拷貝/μL、1.32×104拷貝/μL和2.47×104拷貝/μL。該方法可用于甘薯植株和薯塊中病毒的檢測(cè)，為SPVD的監(jiān)測(cè)預(yù)警提供了一個(gè)有用的工具。
　　 (2)建立了利用NCM-ELISA、R

4、T-PCR和半巢式RT-PCR檢測(cè)煙粉虱中SPCSV的方法，比較了3種檢測(cè)方法的靈敏性。結(jié)果表明，NCM-ELISA最低能從16頭帶毒煙粉虱中檢測(cè)出SPCSV；RT-PCR能從單頭煙粉虱中檢測(cè)出SPCSV，但需要從3頭以上帶毒煙粉虱中才能穩(wěn)定地檢測(cè)出SPCSV；半巢式RT-PCR能穩(wěn)定地從單頭煙粉虱中檢測(cè)出SPCSV。檢測(cè)靈敏性研究表明，用體外轉(zhuǎn)錄的RNA作為核酸模板，RT-PCR可檢測(cè)的最低濃度為5.69×104拷貝/μL，半巢式RT

5、-PCR為5.69×101拷貝/μL，說明半巢式RT-PCR的檢測(cè)方法的靈敏性比RT-PCR高1000倍。
　　 (3)利用RT-PCR方法，對(duì)我國甘薯主產(chǎn)區(qū)14個(gè)省(市)的18個(gè)SPCSV分離物的外殼蛋白(CP)基因和RNA13’端序列的進(jìn)行了擴(kuò)增、克隆和序列分析。CP基因序列分析結(jié)果顯示，18個(gè)SPCSV分離物均為WA株系，CP基因之間核苷酸序列的相似性在98.4％～100％之間，說明目前侵染我國甘薯的SPCSV的CP基因分