一種復(fù)合微生物系統(tǒng)的構(gòu)建及其在降解稻殼纖維素中的應(yīng)用研究.pdf

1、自從日本琉球大學(xué)比嘉照夫教授于20世紀(jì)80年代初期研制出一種新型復(fù)合微生物菌劑—有效微生物群EM(EffectiveMicroorganisms)以來，復(fù)合微生物的應(yīng)用現(xiàn)已普及到全世界包括中國在內(nèi)的60多個(gè)國家，并取得了顯著的經(jīng)濟(jì)效益、社會效益和生態(tài)效益。多菌種混合發(fā)酵相對單菌種發(fā)酵有很多優(yōu)勢：提高生產(chǎn)效率和微生物生長速度，可利用營養(yǎng)成分比較單一的廉價(jià)的農(nóng)副產(chǎn)品，并且還可以防至發(fā)酵污染。纖維素酶是一種復(fù)合酶，由內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖纖

2、維二糖水解酶和纖維二糖酶的協(xié)同作用下才能水解成葡萄糖。目前，影響纖維素材料綜合利用的關(guān)鍵問題纖維素酶的酶解效率不高，在纖維素利用過程中產(chǎn)生明顯的產(chǎn)物(纖維二糖和葡萄糖)阻遏纖維素酶系的表達(dá)，直接影響纖維素酶系對纖維素材料的協(xié)同作用效率。為提高纖維素酶系的酶解效率，本文采用構(gòu)建多菌種混合發(fā)酵體系發(fā)酵軟化具有特殊結(jié)晶結(jié)構(gòu)纖維素的稻殼，一方面通過體系中各菌種產(chǎn)酶情況調(diào)節(jié)纖維素酶系中各組分之間的協(xié)同作用，另一方面通過體系中的一些菌種及時(shí)利用纖維

3、素酶解產(chǎn)物以解除底物和降解物對酶的影響。 本文的主要研究內(nèi)容和結(jié)果 1、根據(jù)纖維素酶系的組成特點(diǎn)及作用機(jī)制和微生物的生理特性篩選生長條件相似的多菌種組成發(fā)酵稻殼的復(fù)合微生物體系：根據(jù)綠色木霉纖維素酶系組分較全，但β-葡萄糖苷酶活力比較低，而黑曲霉的β-葡萄糖苷酶活力比較高的特點(diǎn)，選定綠色木霉AS3.3711和黑曲霉3.316作為產(chǎn)纖維素酶的菌種來源，再根據(jù)啤酒酵母AS2.399、產(chǎn)朊假絲酵母1817和德氏乳桿菌都可利用還

4、原單糖的特性，在以后的實(shí)驗(yàn)中將從這三種菌中篩選出最佳的第三種菌與前兩種菌一起復(fù)合發(fā)酵以解除產(chǎn)物反饋抑制作用。 2、把綠色木霉、黑曲霉分別進(jìn)行單菌種發(fā)酵，初步掌握各單菌發(fā)酵稻殼的最佳發(fā)酵條件，定出以下條件作為復(fù)合微生物發(fā)酵的參考：稻殼預(yù)處理的NaOH濃度2.0％、處理溫度50℃(24h)、發(fā)酵pH5.0-5.5、發(fā)酵培養(yǎng)基含水量100％。 3、通過做對比實(shí)驗(yàn)從啤酒酵母AS2.399、產(chǎn)朊假絲酵母1817和德氏乳桿菌中篩選出

5、最佳的第三種菌與綠色木霉和黑曲霉一起復(fù)合發(fā)酵以解除產(chǎn)物反饋抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是FPA(filterpaperenzymeactivity)還是纖維降解率，啤酒酵母的效果最好，產(chǎn)朊假絲酵母次之，而德氏乳桿菌最差；且最高酶活基本上在發(fā)酵的第七天出現(xiàn)，而纖維降解率都是在第九天之后幾乎沒有什么變化。所以，本實(shí)驗(yàn)的復(fù)合微生物體系最終選定由啤酒酵母AS2.399、綠色木霉AS3.3711和黑曲霉3.316構(gòu)成。 4、一方面參考綠色木霉

6、和黑曲霉的單菌種發(fā)酵條件，一方面根據(jù)發(fā)酵需要重新設(shè)計(jì)十因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果得到復(fù)合微生物發(fā)酵稻殼的十個(gè)最佳條件如下：稻殼預(yù)處理溫度30℃，NaOH濃度3％，發(fā)酵溫度30℃，黑曲霉接種時(shí)間Od(與綠色木霉同在第一天接種即與綠色木霉接種時(shí)間差為Od)，發(fā)酵pH4.5，啤酒酵母接種時(shí)間6d(比綠色木霉接種時(shí)間晚6d)，培養(yǎng)基含水量80％，綠色木霉接種量為每20g干培養(yǎng)基中接入濃度為1×108cell/ml的孢子液2ml，黑曲霉接種量也為

7、每20g干培養(yǎng)基中接入濃度為1×108cell/ml的孢子液2ml，啤酒酵母接種量為每20g干培養(yǎng)基中接入濃度為1×1010cell/ml菌液1ml。 5、在已確定的最優(yōu)發(fā)酵條件下，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的組成。由于涉及的因素比較多，僅采用正交設(shè)計(jì)各因素水平數(shù)就不能過多，而多水平實(shí)驗(yàn)對于優(yōu)選培養(yǎng)基組成是必需的。所以采用正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)相結(jié)合的方法對固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的無機(jī)鹽及金屬鹽成分進(jìn)行優(yōu)化篩選，最后用微機(jī)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得

8、到兩個(gè)回歸方程，并由兩方程分別得出預(yù)測極值點(diǎn)和最高FPA及纖維降解率的預(yù)測值，再綜合考慮兩方程的預(yù)測極值點(diǎn)和生產(chǎn)成本選出最優(yōu)培養(yǎng)基配方為0.20％的土溫80、0.10％(NH4)2SO4、0.20％(NH2)2CO和0.08％的KH2PO4，預(yù)測FPA為5.77U/g，纖維降解率32.38％。然后，進(jìn)一步作實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為FPA為5.64U/g，纖維降解率為28.05％，這與預(yù)測值基本相符，證明此優(yōu)化培養(yǎng)基配方是有效的。

9、 6、在最佳發(fā)酵條件下對最優(yōu)配方的稻殼培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，把復(fù)合微生物發(fā)酵和單菌種發(fā)酵作對比實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)綠色木霉的最高酶活力發(fā)生在第5天，纖維降解率在第12天后幾乎沒什么變化，而黑曲霉最高酶活力卻發(fā)生在第2天，纖維降解率在6天后沒有變化，并且綠色木霉的酶活力比黑曲霉低。把黑曲霉和綠色木霉兩種菌混合，最高FPA發(fā)生在第6天，纖維降解率在9天之后無變化，最高酶活比綠色木霉高，但比黑曲霉低，而纖維降解率比任一單菌高。當(dāng)把綠色木霉和黑曲霉及酵母三

10、種菌混合培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)最高酶活力發(fā)生的時(shí)間延長到了第7天，但其酶活力仍比黑曲霉單菌種發(fā)酵以及黑曲霉與綠色木霉混合發(fā)酵的低，比綠色木霉單菌種發(fā)酵高，而纖維降解率則在10天后沒有什么變化，且比兩種單菌及其混合發(fā)酵都高。這主要是酵母菌的加入解除了產(chǎn)物的反饋抑制，從而大大提高了纖維降解率。通過此實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了本課題構(gòu)建的由啤酒酵母AS2.399、綠色木霉AS3.3711和黑曲霉3.316組成的復(fù)合微生物體系在實(shí)際中的應(yīng)用符合了我們最初的理論設(shè)計(jì)，三菌