野生茄子StCYP51和StCYP77A2基因的克隆及抗病性分析.pdf

1、細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450)是一類血紅素氧化酶，它在細(xì)菌、動(dòng)物和植物中普遍存在。CYP450在生物細(xì)胞中通過(guò)可逆性變化而進(jìn)行電子傳遞，參與多種重要的生物代謝過(guò)程。在真核生物中，作為一種膜結(jié)合蛋白，CYP450主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、微粒體和線粒體內(nèi)膜上。植物CYP450具有廣泛的催化活性，其功能可歸為參與生物合成途徑和參與生物解毒途徑兩大類。以往的研究表明，CYP450可能參與野生茄子托魯巴姆對(duì)黃萎病菌防衛(wèi)反應(yīng)過(guò)程，但其

2、功能仍有待研究。
　　 本研究從大麗輪枝菌誘導(dǎo)的托魯巴姆差異表達(dá)cDNA文庫(kù)中挑選CYP51和CYP77A2片段作為研究對(duì)象，采用同源克隆法擴(kuò)增這兩個(gè)基因，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化再生CYP51和CYP77A2轉(zhuǎn)基因煙草植株，進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的黃萎病抗性進(jìn)行了鑒定。結(jié)果如下:
　　 StCYP51基因的克隆與分析。采用RT-PCR方法，擴(kuò)增得到了StCYP51基因的編碼序列。StCYP51基因ORF長(zhǎng)度為1464bp，起始密碼子為

3、ATG，終止密碼子為TAA，cDNA編碼一個(gè)由487個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，蛋白分子量為55.33kDa，理論等電點(diǎn)為8.35。為了分析StCYP51的功能，構(gòu)建了pCB2008E-StCYP51過(guò)表達(dá)載體。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將StCYP51基因轉(zhuǎn)入煙草NC89中，共得到潮霉素抗性煙草14個(gè)株。Southern雜交檢測(cè)顯示，一個(gè)株系有雜交信號(hào)，顯示為單拷貝。在轉(zhuǎn)基因株系中StCYP51的mRNA水平明顯高于野生型對(duì)照。對(duì)轉(zhuǎn)StCYP51基

4、因植株的黃萎病菌抗性進(jìn)行了分析，其病情指數(shù)和發(fā)病率分別為52.78和88.79％，低于對(duì)照的77.78和100％。
　　 StCYP77A2基因的克隆與分析。采用RT-PCR的方法，擴(kuò)增得到了StCYP77A2的編碼序列。StCYP77A2基因ORF長(zhǎng)度為1536bp，起始密碼子為ATG;終止密碼子為TAA。該cDNA編碼一個(gè)由511個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白。蛋白分子量為58.08 kDa，理論等電點(diǎn)為9.17。為了分析StCYP

5、77A2的功能，構(gòu)建了pCB2008E-StCYP77A2過(guò)表達(dá)載體。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將StCYP77A2基因轉(zhuǎn)入煙草NC89中，共得到潮霉素抗性煙草11個(gè)株。Southern雜交檢測(cè)顯示，兩個(gè)株系有雜交信號(hào)，皆為雙拷貝。在轉(zhuǎn)基因株系中StCYP77A2的mRNA水平均明顯高于野生型對(duì)照。對(duì)轉(zhuǎn)StCYP77A2基因植株的黃萎病菌抗性進(jìn)行了分析，其病情指數(shù)和發(fā)病率分別為33.33和33.33，低于對(duì)照的77.78和100％。