利用轉基因策略創(chuàng)造高淀粉、高直鏈淀粉玉米新種質.pdf

1、玉米是最重要的糧食和飼料作物之一，也是食品和化工的重要原料，在人類生活中起著舉足重輕的作用。全世界淀粉年產(chǎn)量為3600萬噸，其中80％以上是玉米淀粉，加強高淀粉玉米育種具有重要的社會效益和經(jīng)濟效益。直鏈淀粉是重要的工業(yè)原料，用途廣泛，涉及到各個領域，如食品、塑料、醫(yī)療等行業(yè)。但是普通玉米的直鏈淀粉含量約22％-28％，從普通玉米提取直鏈淀粉成本很高。目前，我國所需的直鏈淀粉主要依賴進口，價格昂貴。采用常規(guī)育種技術選育高直鏈淀粉玉米遇到的

2、主要問題是玉米淀粉總含量減少，籽粒含水分量增高，利用基因工程技術進行高直鏈淀粉玉米品種培育是一種值得探索的途徑。過表達AGPase提高玉米淀粉含量和籽粒產(chǎn)量
　　 淀粉合成的主要場所是淀粉體和葉綠體，整個過程受到一系列酶活性的調控。ADP-葡萄糖焦磷酸化酶是淀粉合成途徑的限速酶，主要功能是把1-磷酸葡萄糖轉化為合成淀粉的底物ADPG。過表達AGPase基因有可能提高AGPase的活性，促進淀粉合成。玉米AGPase是由兩個大亞基

3、和兩個小亞基組成的異四聚體，大、小亞基分別由Sh2和Bt基因編碼。該酶在玉米籽粒發(fā)育和淀粉合成中發(fā)揮著至關重要的作用。
　　 本工作通過RT-PCR的方法從玉米胚乳cDNA中克隆出玉米AGPase的大、小亞基基因Sh2和Bt2，選用玉米胚乳特異性啟動子啟動Sh2和Bt2基因表達，以除草劑抗性基因為選擇標記，構建出Sh2、Bt2單基因過表達植物載體和二者串聯(lián)的過表達植物載體。采用農(nóng)桿菌介導的玉米芽尖遺傳轉化方法，將三種載體上目標基

4、因分別轉入玉米骨干自交系昌7-2和掖478。PCR和Southern檢測證明，外源基因整合到轉基因玉米植株的基因組內，并在后代中穩(wěn)定表達，選擇來源于不同獨立轉化體的且外源基因單拷貝插入的株系進行轉基因表達、淀粉合成、籽粒產(chǎn)量及其它農(nóng)藝性狀的研究。
　　 對不同灌漿期(10DAP，15DAP，20DAP，30DAP)的轉基因純合植株及其野生型對照的籽粒進行基因表達分析和酶活性測定，對成熟后的種子進行淀粉含量分析和百粒重測定，發(fā)現(xiàn)A

5、GPase基因的表達和酶活性在籽粒發(fā)育前期都隨著發(fā)育進程而增加，在20DAP時達到高峰，隨后緩慢下降。在檢查的轉基因植株中AGPase基因的表達強度顯著高于非轉基因植株的，酶活性也發(fā)生相應的變化，轉Sh2或Bt2基因的植株變化幅度小于轉Sh2和Bt2雙基因的植株的，轉Sh2基因和Bt2基因的植株之間的差異不明顯。成熟種子的淀粉含量分析表明，淀粉含量的變化與基因表達和酶活性變化呈現(xiàn)一致的趨勢。在轉Sh2或Bt2基因的株系中，淀粉含量分別由

6、野生型的66％(昌7-2)或65％(掖478)升高到71～74％不等；而轉Sh2和Bt2雙基因的株系中，淀粉含量增加到76～78％，較野生型對照提高約16.7％。轉基因植株的百粒重也有明顯提高，與對照昌7-2相比，轉基因株系的百粒重分別提高20％(Bt2)、18％(Sh2)和30％(Bt2Sh2)；與對照掖478相比，轉基因株系的百粒重分別提高22％(Bt2)、20％(Sh2)和33％(Bt2Sh2)。通過不同株系植株的盆栽和大田比較試

7、驗得出，轉基因植株生長正常，果穗長、穗行數(shù)、籽粒數(shù)等與對照植株的差異不顯著，而穗重、百粒重、淀粉含量則變化顯著，較非轉基因植株有明顯提高。果實籽粒大小也有明顯變化，轉Sh2租Bt2雙基因的植株增加最顯著。
　　 在本工作采用來自玉米醇溶蛋白基因的胚乳特異型啟動子，大大增強了AGPase基因在玉米胚乳中的表達。過表達Bt2基因或Sh2基因都能提高AGPase活性，而Bt2和Sh2基因的共同過表達將AGPase活性提高到一個顯著水平

8、。這意味著玉米胚乳AGPase活性的增強可能是通過增強四聚體數(shù)量及其穩(wěn)定性來實現(xiàn)，胚乳Sh2或Bt2蛋白的大量增多使AGPas四聚體更趨于穩(wěn)定或有更多的四聚體形成。灌漿期胚乳AGPase活性的增加，不僅可加速碳水化合物的轉化和轉運，促進胚乳淀粉合成，提高種子的增重速率，間接促進光合作用，最終提高玉米產(chǎn)量。因此，可通過提高玉米胚乳內AGPase活性培育出光合效率高、籽粒產(chǎn)量高和淀粉含量高的玉米新品種。本工作是一個成功的實例，為培育玉米優(yōu)良

9、自交系提供一個切實可行的途徑。
　　 利用RNAi機制創(chuàng)制高直鏈淀粉玉米新材料
　　 直鏈淀粉的合成受多基因控制，復雜的基因環(huán)境互作也參與影響胚乳直鏈淀粉的含量。增加胚乳直鏈淀粉的含量往往伴隨著產(chǎn)量和其它農(nóng)藝性狀的降低。淀粉分支酶是淀粉生物合成過程中一個起重要調節(jié)作用的酶，它能切開葡萄糖間的α(1，4)糖苷鍵，并把切下的短鏈通過α(1，6)糖苷鍵連接于受體鏈上，形成分枝結構，抑制淀粉分支酶基因的表達可降低酶活性，從而減少

10、支鏈淀粉合成，提高直鏈淀粉的含量。玉米淀粉分支酶SBE可分為三種同工酶SBEI、SBEIIa和SBEIIb，其中SBEIIb對胚乳直鏈淀粉含量的作用最大。
　　 本論文通過RT-PCR的方法從玉米胚乳cDNA中克隆出玉米淀粉分支酶基因SBEIIα、IIb的特異區(qū)和保守區(qū)片段，分別構建出SBE的RNAi結構，后者由胚乳特異的啟動子P27Kd或組成性啟動子35S驅動。為了獲得最優(yōu)的干擾效果，使直鏈淀粉大幅度的提高以滿足塑料工業(yè)的需要

11、，分別以SBEIIα和SBEIIb保守序列為基礎，構建出hpRNA臂長分別為893bp和467bp的RNAi結構；以SBEIIα中長度為417bp和154bp的特異序列分別與SBEIIb的一段295bp的特異序列相連接，構建不同的hpRNA結構；選用不同RNAi結構內含子和不同的啟動子，構建具有特定的RNAi結構。通過常規(guī)的分子生物學技術，將這些RNAi結構重組到植物表達載體中，獲得了10個具有不同特點的植物表達載體。通過農(nóng)桿菌介導法將

12、不同RNAi結構導入玉米骨干自交系昌7-2，從轉化植株后代中篩選出7個轉化結構生產(chǎn)的穩(wěn)定轉基因株系。除草劑抗性篩選、PCR檢測和Southern blotting驗證及轉基因表達強度分析肯定我們獲得了轉基因純合株系，RNAi結構穩(wěn)定插入到玉米基因組中。
　　 選擇來源于不同獨立轉化體且外源基因單拷貝插入的轉RNAi結構的株系進行農(nóng)藝性狀觀察和基因表達強度、SBE酶活性、籽粒淀粉含量、直鏈淀粉含量測定，得出轉入的RNAi結構有效抑

13、制了SBEII基因的表達，大幅度降低了胚乳SBE的酶活性，與野生型對照相比顯著提高了直鏈淀粉含量，植株形態(tài)特征和生長發(fā)育無明顯變化，但總淀粉含量及籽粒產(chǎn)量有一定降低。
　　 在灌漿期20DAP時測定SBEII的基因表達強度和SBE酶活性，得出轉RNAi結構的植株SBEII的基因表達強度和SBE酶活性都有不同程度的降低，轉35S啟動RNAi結構的株系抑制效率低于27Kd啟動的；用SBEIIb不同長度的保守序列構建的RNAi結構，干

14、擾效果差別不大；由SBEIIα和SBEIIb特異區(qū)構建的RNAi結構抑制效果最好。含較短內含子的RNAi結構抑制效率相對較高。
　　 測定轉RNAi結構植株和對照植株的成熟種子的胚乳直鏈淀粉和總淀粉含量，對帶有不同RNAi結構的株系進行比較，得出以SBEIIb保守區(qū)為基礎構建的不同臂長的RNAi結構對直鏈淀粉含量的影響彼此無明顯差異，而以SBEIIα特異序列各SBEIIb特異序列相連構成的RNAi結構似乎臂長712bp的優(yōu)于34

15、9bp的；由SBEIIα特異序列和SBEIIb特異序列相連構成的RNAi結構提高直鏈淀粉的幅度大于僅由SBEIIb保守序列組成的；P27Kd啟動子驅動的RNAi結構對直鏈淀粉提高的程度高于35S啟動子驅動的，并且轉基因植株形態(tài)和生長發(fā)育更類似于野生型對照的；用catalase intron替換pFGC5941載體中的內含子可使合成更多的直鏈淀粉。伴隨著胚乳直鏈淀粉含量的增加，籽粒淀粉總含量和百粒重降低。同時干擾SBEIIα和SBEIIb

16、的株系直鏈淀粉含量達到55％(盆栽)或54％(大田)，總淀粉含量不到60％，總淀粉含量較非轉基因對照65％降低了10％，而百粒重只有17g，約為非轉基因對照的(20.2g/100粒)84％。抑制SBE的活性，對淀粉合成可能有限制作用，從而導致淀粉含量減少、百粒重的降低。
　　 在田間比較試驗中，通過對轉基因植株的株高、穗位高、果穗長、穗重等多個性狀的分析，得出轉基因植株性狀與非轉基因植株相比較變化不明顯，只是在轉35S啟動子驅動

17、的RNAi結構植株中株高和葉片面積低于野生型的。
　　 本工作獲得了玉米高直鏈淀粉新種質，并為玉米RNAi結構的設計和采用轉基因技術獲得高直鏈淀粉玉米的工作積累了重要資料。
　　 通過轉基因植株的雜交培育高淀粉高直鏈淀粉玉米材料
　　 采用RNAi的方法，我們得到了直鏈淀粉高達55％的玉米株系，而總淀粉含量卻低于野生型對照的，為了解決總淀粉含量降低，產(chǎn)量下降的問題，有必要將能夠提高淀粉合成限速步驟的過表達載體引入

18、高直鏈淀粉玉米體中，使其胚乳內AGPase的活性能夠得到提高，從而推動有更多的碳水化合物用于胚乳淀粉合成，增加淀粉含量和玉米產(chǎn)量。本工作中，用于雜交的親本材料選取淀粉含量最高的轉AGPase大小亞基基因的轉基因植株和RNAi效果較好高直鏈淀粉植株，轉基因材料的受體基因型均為昌7-2。
　　 以3個轉過表達基因的植株為父本，以3個轉RNAi結構的植株為母本，這些植株分別來自不同的轉基因純合株系，進行成對雜交，產(chǎn)生轉基因聚合的F1代

19、。Southern雜交結果顯示，過表達AGPase基因結構和RNAi結構均存在于轉基因聚合植株的基因組中。
　　 將帶有過表達AGP酶基因和RNAi結構的轉基因聚合植株F1代、未轉基因對照的姊妹交種子、高淀粉玉米姊妹交種子和高直鏈淀粉姊妹交種子播種于相同的花盆中，在適應條件下生長，套袋自交，測定籽粒20DAP時的目標基因表達水平和酶活性，籽粒成熟干燥后成對胚乳淀粉含量和直鏈淀粉含量，同時觀察記載植株形態(tài)特征和株高、百粒重等農(nóng)藝性

20、狀的變化。
　　 在轉基因聚合株系胚乳中，Bt2、Sh2的表達豐度較父本玉米植株的稍低，仍顯著高于未轉基因對照的，AGPase活性表現(xiàn)出相同的變化趨勢；而SBEII的表達水平較母本略有升高，但達不到差異顯著水平，仍大幅度低于未轉基因對照的，SBE活性變化表現(xiàn)出同樣趨勢。即在轉基因聚合株系中，過表達AGPase和抑制SBE都得到實現(xiàn)。測定胚乳淀粉含量和直鏈淀粉含量，得出轉基因聚合植株的直鏈淀粉含量雖較母本有所下降，但依然高于50％

21、，遠大于未轉基因對照的28％。轉基因聚合植株的淀粉含量約71％，比非轉基因對照(66％)提高了6％，但與高淀粉父本植株(78％)相比仍有較大差距。轉基因聚合植株生長發(fā)育生長，株高、穗位高、穗長和籽粒表型較非轉基因植株變化不顯著，但轉基因聚合植株的百粒重比轉RNAi結構的高直鏈淀粉植株提高了18％以上，比未轉基因對照昌7-2相近或略高。即轉基因聚合植株中既擁有較高的直鏈淀粉含量、又有提高了淀粉含量，為獲得高淀粉高直鏈淀粉含量的玉米提高了成

22、功的實例。
　　 綜上所述，本論文工作首次獲得了利用過表達AGPase大小亞基雙基因的方法使玉米淀粉含量和籽粒體積顯著提高的高淀粉玉米新種質；以RNAi技術獲得了淀粉含量達55％的高直鏈淀粉玉米，并比較了不同RNAi結構對靶基因表達的抑制效果；通過不同轉基因植株雜交的方式實現(xiàn)過表達AGPase基因和抑制SBEII基因表達在玉米胚乳中同時實現(xiàn)，獲得了高淀粉高直鏈淀粉玉米新材料。這些工作為培育具有巨大經(jīng)濟價值的高淀粉玉米、高直鏈淀粉