取食雙鏈RNA對棉鈴蟲的基因干擾和毒理學(xué)效應(yīng).pdf

1、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）屬鱗翅目夜蛾科，是一種世界性的重要農(nóng)業(yè)害蟲，在我國為常發(fā)性害蟲。防治棉鈴蟲所使用的大多數(shù)化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境和人類健康有害，而目前開發(fā)的轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的安全性也存在某些爭議。因此在理論研究的基礎(chǔ)上，開發(fā)新型生物農(nóng)藥一直是害蟲防治的研究熱點(diǎn)。
　　 基因沉默(RNAi)技術(shù)作為新興的生物技術(shù)，已經(jīng)越來越多地應(yīng)用到生命科學(xué)的各個領(lǐng)域，植物保護(hù)學(xué)也試圖將其應(yīng)用到農(nóng)業(yè)害蟲的防治上。目前大多數(shù)昆

2、蟲RNAi是應(yīng)用喂食和注射的方法來研究的，也有報道通過轉(zhuǎn)基因的方式，使植物表達(dá)害蟲基因的雙鏈RNA（dsRNA），從而干擾取食這些轉(zhuǎn)基因植物害蟲的基因，實現(xiàn)控制害蟲危害的目的。但是，要應(yīng)用RNAi技術(shù)進(jìn)行重要農(nóng)業(yè)害蟲的防治，為現(xiàn)代植保提供一條具有廣闊發(fā)展前景的害蟲防控新途徑，首先必須通過基礎(chǔ)研究，解決害蟲RNAi的效率和安全性問題。
　　 本文研究了dsRNA對棉鈴蟲基因的干擾及其毒理學(xué)效應(yīng)，比較了幾種不同dsRNA遞送方法誘導(dǎo)

3、的基因沉默效應(yīng)，確定了最高效的dsRNA遞送方法和最敏感的棉鈴蟲基因沉默檢測參數(shù);比較了不同基因的沉默效應(yīng);分析了影響基因沉默效應(yīng)的dsRNA特征，為設(shè)計高效dsRNA奠定了理論基礎(chǔ);比較了在不同條件下dsRNA的降解速率，揭示了dsRNA在昆蟲體內(nèi)的降解規(guī)律，以及注射和喂食dsRNA產(chǎn)生不同沉默效應(yīng)的原因，為選擇有效的dsRNA遞送方法提供了理論依據(jù)?，F(xiàn)將具體研究結(jié)果總結(jié)如下:
　　 1.利用簡并引物，采用巢式PCR等分子生物

4、學(xué)技術(shù)對棉鈴蟲的蛻皮激素受體（EcR）和超氣門蛋白（USP）的基因片段進(jìn)行克隆，并對序列進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，克隆得到的兩個基因片段EcR-501和USP-600與其他鱗翅目昆蟲的這兩個基因有高達(dá)80％～90％的相似性，表明克隆得到的基因片段是棉鈴蟲蛻皮激素受體和超氣門蛋白基因序列。隨后又參照NCBI中新登錄的蛻皮激素受體序列以及登錄的幾丁質(zhì)酶(Chi)全長序列和熱激同源蛋白70（Hsc70）全長序列設(shè)計特異引物，克隆了棉鈴蟲蛻皮激素受

5、體上的另一個片段EcR-347;幾丁質(zhì)酶上的四個片段:Chi，Chi-2，Chi3'和Chi3'-2以及熱激同源蛋白70上的一個片段Hsc70-352。測序后與NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄的序列進(jìn)行比對，顯示克隆的這6個基因片段均為目標(biāo)基因片段。這些基因片段的成功克隆為下一步基因沉默試驗奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.通過構(gòu)建dsRNA表達(dá)載體，以及發(fā)酵條件的優(yōu)化，建立了體外dsRNA合成的菌液發(fā)酵技術(shù)。發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)菌發(fā)酵液的OD600為4.0時，

6、加入IPTG至終濃度0.25mM進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)搖菌5小時，為dsRNA生產(chǎn)最佳培養(yǎng)程序。
　　 3.比較了注射dsRNA、喂食dsRNA和喂食表達(dá)dsRNA的細(xì)菌液3種dsRNA遞送方法介導(dǎo)的基因沉默效應(yīng)。結(jié)果表明單次注射dsRNA的棉鈴蟲幼蟲死亡率與對照沒有顯著差異，但試蟲化蛹成功率降低了42.5％，發(fā)育異常率提高了6.4倍。單次喂食dsRNA沒有顯著的表現(xiàn)型差異，但連續(xù)喂食dsRNA的基因沉默效應(yīng)顯著，不僅試蟲的化蛹成功率下

7、降了41.7％，發(fā)育異常率提高了4.9倍，同時幼蟲死亡率也升高了3.5倍。同樣，連續(xù)喂食表達(dá)dsRNA的細(xì)菌液，也可以使棉鈴蟲產(chǎn)生顯著的基因沉默效應(yīng)，喂食表達(dá)dsUSP細(xì)菌液的處理組試蟲的化蛹成功率(27.1％)比dsEGFP細(xì)菌液處理的對照試蟲的化蛹成功率(86.1％)顯著降低，幼蟲死亡率(41.7％)是對照組(11.1％)的3.8倍，試蟲的發(fā)育異常率(31.3％)是對照組(2.8％)的11.2倍。定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，連續(xù)喂食dsUS

8、P細(xì)菌液120小時后，棉鈴蟲超氣門蛋白基因的表達(dá)量下降為對照的40.3％。綜合比較分析發(fā)現(xiàn)，dsRNA不同遞送方法中，以連續(xù)喂食表達(dá)dsRNA的細(xì)菌液介導(dǎo)的昆蟲基因沉默效應(yīng)最顯著，而且操作簡便，成本低廉。此外，比較不同觀測指標(biāo)檢測棉鈴蟲基因沉默的效應(yīng)發(fā)現(xiàn)，處理試蟲的發(fā)育異常率是最敏感的檢測參數(shù)，其次為化蛹成功率，幼蟲死亡率的敏感性相對較差。
　　 4.本研究利用表達(dá)dsRNA的細(xì)菌液，連續(xù)喂食棉鈴蟲，比較不同基因的沉默效應(yīng)。結(jié)果

9、顯示，喂食表達(dá)dsHsc70細(xì)菌液的處理組試蟲熱激同源蛋白70基因的表達(dá)量為對照的115％，沒有顯著差異，試蟲的生長發(fā)育也沒有顯著變化。但喂食表達(dá)dsChi-2和dsEcR細(xì)菌液的棉鈴蟲幾丁質(zhì)酶和蛻皮激素受體基因的表達(dá)量分別下降到對照的37.2％和80.3％，且化蛹成功率也顯著降低，分別為對照的53.2％和79.1％。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，喂食表達(dá)dsChi-2細(xì)菌液的棉鈴蟲體重增長緩慢，幼蟲死亡率(49.3％)顯著高于對照(11.1％)

10、，但發(fā)育異常率沒有顯著變化。而喂食表達(dá)dsEcR細(xì)菌的試蟲發(fā)育異常率(14.6％)顯著高于對照(2.8％)，但體重增長速率和幼蟲死亡率與對照沒有顯著差異。由此可知，在RNA干擾研究中，并不是所有的被干擾基因都會表現(xiàn)出明顯的沉默效應(yīng);并且在相同dsRNA濃度下，不同基因的dsRNA在同一昆蟲中并不一定都能產(chǎn)生相同的表型沉默效應(yīng)。因此，為了獲得顯著的沉默效應(yīng)，靶基因的選擇至關(guān)重要。本研究還表明棉鈴蟲幾丁質(zhì)酶基因和蛻皮激素受體基因可以作為RN

11、Ai防治害蟲的靶基因，為農(nóng)業(yè)害蟲無公害治理提供了重要的基因資源。
　　 5.以棉鈴蟲幾丁質(zhì)酶為目標(biāo)基因，研究了dsRNA的劑量、位置和長度三個特征對沉默效應(yīng)的影響，結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)提高dsRNA劑量能提高基因沉默效應(yīng)，而超過了一定劑量后，即使繼續(xù)提高dsRNA劑量也不會對沉默效應(yīng)產(chǎn)生顯著影響。dsRNA靶向位置試驗結(jié)果表明，無論是靶向基因的編碼區(qū)還是UTR區(qū)，dsRNA都能抑制靶基因的表達(dá)，只是位置不同抑制程度有明顯差異，

12、但這種差異與dsRNA靶向位置沒有固定的關(guān)系。dsRNA長度對沉默效應(yīng)的影響試驗表明，大于50bp的dsRNA均能有效地沉默靶基因，且不同長度dsRNA的沉默效應(yīng)沒有顯著差異。但當(dāng)dsRNA的長度縮短至25bp時，則無法對靶基因產(chǎn)生顯著的沉默效應(yīng)。本研究結(jié)果為設(shè)計高效的dsRNA提供了理論依據(jù)。
　　 6.本研究探討了不同遞送方法對dsRNA穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)dsRNA在血淋巴中被快速降解成小分子dsRNA，但這種小分子dsRN