取食雙鏈RNA對(duì)棉鈴蟲(chóng)的基因干擾和毒理學(xué)效應(yīng).pdf

1、棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera）屬鱗翅目夜蛾科，是一種世界性的重要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，在我國(guó)為常發(fā)性害蟲(chóng)。防治棉鈴蟲(chóng)所使用的大多數(shù)化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境和人類(lèi)健康有害，而目前開(kāi)發(fā)的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物的安全性也存在某些爭(zhēng)議。因此在理論研究的基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)新型生物農(nóng)藥一直是害蟲(chóng)防治的研究熱點(diǎn)。
　　 基因沉默(RNAi)技術(shù)作為新興的生物技術(shù)，已經(jīng)越來(lái)越多地應(yīng)用到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，植物保護(hù)學(xué)也試圖將其應(yīng)用到農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的防治上。目前大多數(shù)昆

2、蟲(chóng)RNAi是應(yīng)用喂食和注射的方法來(lái)研究的，也有報(bào)道通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方式，使植物表達(dá)害蟲(chóng)基因的雙鏈RNA（dsRNA），從而干擾取食這些轉(zhuǎn)基因植物害蟲(chóng)的基因，實(shí)現(xiàn)控制害蟲(chóng)危害的目的。但是，要應(yīng)用RNAi技術(shù)進(jìn)行重要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的防治，為現(xiàn)代植保提供一條具有廣闊發(fā)展前景的害蟲(chóng)防控新途徑，首先必須通過(guò)基礎(chǔ)研究，解決害蟲(chóng)RNAi的效率和安全性問(wèn)題。
　　 本文研究了dsRNA對(duì)棉鈴蟲(chóng)基因的干擾及其毒理學(xué)效應(yīng)，比較了幾種不同dsRNA遞送方法誘導(dǎo)

3、的基因沉默效應(yīng)，確定了最高效的dsRNA遞送方法和最敏感的棉鈴蟲(chóng)基因沉默檢測(cè)參數(shù);比較了不同基因的沉默效應(yīng);分析了影響基因沉默效應(yīng)的dsRNA特征，為設(shè)計(jì)高效dsRNA奠定了理論基礎(chǔ);比較了在不同條件下dsRNA的降解速率，揭示了dsRNA在昆蟲(chóng)體內(nèi)的降解規(guī)律，以及注射和喂食dsRNA產(chǎn)生不同沉默效應(yīng)的原因，為選擇有效的dsRNA遞送方法提供了理論依據(jù)。現(xiàn)將具體研究結(jié)果總結(jié)如下:
　　 1.利用簡(jiǎn)并引物，采用巢式PCR等分子生物

4、學(xué)技術(shù)對(duì)棉鈴蟲(chóng)的蛻皮激素受體（EcR）和超氣門(mén)蛋白（USP）的基因片段進(jìn)行克隆，并對(duì)序列進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，克隆得到的兩個(gè)基因片段EcR-501和USP-600與其他鱗翅目昆蟲(chóng)的這兩個(gè)基因有高達(dá)80％～90％的相似性，表明克隆得到的基因片段是棉鈴蟲(chóng)蛻皮激素受體和超氣門(mén)蛋白基因序列。隨后又參照NCBI中新登錄的蛻皮激素受體序列以及登錄的幾丁質(zhì)酶(Chi)全長(zhǎng)序列和熱激同源蛋白70（Hsc70）全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)特異引物，克隆了棉鈴蟲(chóng)蛻皮激素受

5、體上的另一個(gè)片段EcR-347;幾丁質(zhì)酶上的四個(gè)片段:Chi，Chi-2，Chi3'和Chi3'-2以及熱激同源蛋白70上的一個(gè)片段Hsc70-352。測(cè)序后與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的序列進(jìn)行比對(duì)，顯示克隆的這6個(gè)基因片段均為目標(biāo)基因片段。這些基因片段的成功克隆為下一步基因沉默試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.通過(guò)構(gòu)建dsRNA表達(dá)載體，以及發(fā)酵條件的優(yōu)化，建立了體外dsRNA合成的菌液發(fā)酵技術(shù)。發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)菌發(fā)酵液的OD600為4.0時(shí)，

6、加入IPTG至終濃度0.25mM進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)搖菌5小時(shí)，為dsRNA生產(chǎn)最佳培養(yǎng)程序。
　　 3.比較了注射dsRNA、喂食dsRNA和喂食表達(dá)dsRNA的細(xì)菌液3種dsRNA遞送方法介導(dǎo)的基因沉默效應(yīng)。結(jié)果表明單次注射dsRNA的棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)死亡率與對(duì)照沒(méi)有顯著差異，但試蟲(chóng)化蛹成功率降低了42.5％，發(fā)育異常率提高了6.4倍。單次喂食dsRNA沒(méi)有顯著的表現(xiàn)型差異，但連續(xù)喂食dsRNA的基因沉默效應(yīng)顯著，不僅試蟲(chóng)的化蛹成功率下

7、降了41.7％，發(fā)育異常率提高了4.9倍，同時(shí)幼蟲(chóng)死亡率也升高了3.5倍。同樣，連續(xù)喂食表達(dá)dsRNA的細(xì)菌液，也可以使棉鈴蟲(chóng)產(chǎn)生顯著的基因沉默效應(yīng)，喂食表達(dá)dsUSP細(xì)菌液的處理組試蟲(chóng)的化蛹成功率(27.1％)比dsEGFP細(xì)菌液處理的對(duì)照試蟲(chóng)的化蛹成功率(86.1％)顯著降低，幼蟲(chóng)死亡率(41.7％)是對(duì)照組(11.1％)的3.8倍，試蟲(chóng)的發(fā)育異常率(31.3％)是對(duì)照組(2.8％)的11.2倍。定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，連續(xù)喂食dsUS

8、P細(xì)菌液120小時(shí)后，棉鈴蟲(chóng)超氣門(mén)蛋白基因的表達(dá)量下降為對(duì)照的40.3％。綜合比較分析發(fā)現(xiàn)，dsRNA不同遞送方法中，以連續(xù)喂食表達(dá)dsRNA的細(xì)菌液介導(dǎo)的昆蟲(chóng)基因沉默效應(yīng)最顯著，而且操作簡(jiǎn)便，成本低廉。此外，比較不同觀測(cè)指標(biāo)檢測(cè)棉鈴蟲(chóng)基因沉默的效應(yīng)發(fā)現(xiàn)，處理試蟲(chóng)的發(fā)育異常率是最敏感的檢測(cè)參數(shù)，其次為化蛹成功率，幼蟲(chóng)死亡率的敏感性相對(duì)較差。
　　 4.本研究利用表達(dá)dsRNA的細(xì)菌液，連續(xù)喂食棉鈴蟲(chóng)，比較不同基因的沉默效應(yīng)。結(jié)果

9、顯示，喂食表達(dá)dsHsc70細(xì)菌液的處理組試蟲(chóng)熱激同源蛋白70基因的表達(dá)量為對(duì)照的115％，沒(méi)有顯著差異，試蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育也沒(méi)有顯著變化。但喂食表達(dá)dsChi-2和dsEcR細(xì)菌液的棉鈴蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶和蛻皮激素受體基因的表達(dá)量分別下降到對(duì)照的37.2％和80.3％，且化蛹成功率也顯著降低，分別為對(duì)照的53.2％和79.1％。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，喂食表達(dá)dsChi-2細(xì)菌液的棉鈴蟲(chóng)體重增長(zhǎng)緩慢，幼蟲(chóng)死亡率(49.3％)顯著高于對(duì)照(11.1％)

10、，但發(fā)育異常率沒(méi)有顯著變化。而喂食表達(dá)dsEcR細(xì)菌的試蟲(chóng)發(fā)育異常率(14.6％)顯著高于對(duì)照(2.8％)，但體重增長(zhǎng)速率和幼蟲(chóng)死亡率與對(duì)照沒(méi)有顯著差異。由此可知，在RNA干擾研究中，并不是所有的被干擾基因都會(huì)表現(xiàn)出明顯的沉默效應(yīng);并且在相同dsRNA濃度下，不同基因的dsRNA在同一昆蟲(chóng)中并不一定都能產(chǎn)生相同的表型沉默效應(yīng)。因此，為了獲得顯著的沉默效應(yīng)，靶基因的選擇至關(guān)重要。本研究還表明棉鈴蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶基因和蛻皮激素受體基因可以作為RN

11、Ai防治害蟲(chóng)的靶基因，為農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)無(wú)公害治理提供了重要的基因資源。
　　 5.以棉鈴蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶為目標(biāo)基因，研究了dsRNA的劑量、位置和長(zhǎng)度三個(gè)特征對(duì)沉默效應(yīng)的影響，結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)提高dsRNA劑量能提高基因沉默效應(yīng)，而超過(guò)了一定劑量后，即使繼續(xù)提高dsRNA劑量也不會(huì)對(duì)沉默效應(yīng)產(chǎn)生顯著影響。dsRNA靶向位置試驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)論是靶向基因的編碼區(qū)還是UTR區(qū)，dsRNA都能抑制靶基因的表達(dá)，只是位置不同抑制程度有明顯差異，

12、但這種差異與dsRNA靶向位置沒(méi)有固定的關(guān)系。dsRNA長(zhǎng)度對(duì)沉默效應(yīng)的影響試驗(yàn)表明，大于50bp的dsRNA均能有效地沉默靶基因，且不同長(zhǎng)度dsRNA的沉默效應(yīng)沒(méi)有顯著差異。但當(dāng)dsRNA的長(zhǎng)度縮短至25bp時(shí)，則無(wú)法對(duì)靶基因產(chǎn)生顯著的沉默效應(yīng)。本研究結(jié)果為設(shè)計(jì)高效的dsRNA提供了理論依據(jù)。
　　 6.本研究探討了不同遞送方法對(duì)dsRNA穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)dsRNA在血淋巴中被快速降解成小分子dsRNA，但這種小分子dsRN