產(chǎn)ESBLs菌株整合子檢測(cè)及其與耐藥表型的相關(guān)性分析.pdf

1、近年來(lái)隨著抗菌藥物在獸醫(yī)臨床上的大量使用，許多病原菌，尤其是ESBLs陽(yáng)性菌株，廣泛產(chǎn)生了多重耐藥性，這給獸醫(yī)臨床治療帶來(lái)了巨大困難。因此，加強(qiáng)ESBLs陽(yáng)性菌株耐藥機(jī)制的研究對(duì)指導(dǎo)臨床合理用藥，有效控制疾病具有重要意義。本研究采用細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn)方法和PCR檢測(cè)方法探討超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和整合子在ESBLs陽(yáng)性菌株多重耐藥性中的作用，以期為進(jìn)一步闡明ESBLs陽(yáng)性菌株的耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 首先，篩選鑒定了

2、20株ESBLs陽(yáng)性菌株。采用CLSI推薦的ESBLs初篩和確證試驗(yàn)方法對(duì)69株臨床分離鑒定的致病性大腸埃希菌和假單胞菌進(jìn)行ESBLs檢測(cè)。
　　 結(jié)果顯示69株受試菌中檢測(cè)出20株ESBLs陽(yáng)性菌株，檢出率為28.99％，其中致病性大腸埃希菌16株、綠膿桿菌3株和惡臭假單胞菌1株。
　　 其次，從分子水平檢測(cè)了整合子在ESBLs陽(yáng)性菌株中的攜帶情況。以煮沸法提取的細(xì)菌基因組DNA為模板，使用可同時(shí)擴(kuò)增Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類(lèi)整合酶

3、基因的簡(jiǎn)并引物，對(duì)ESBLs陽(yáng)性菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)，并結(jié)合核酸內(nèi)切酶限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析，確定菌株攜帶的整合子類(lèi)型。結(jié)果顯示20株ESBLs陽(yáng)性菌株均攜帶Ⅰ類(lèi)整合子，此外，YD1、YLN和LN1107 3株細(xì)菌同時(shí)攜帶了Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)整合子，即受試菌中Ⅰ和Ⅱ類(lèi)整合子的攜帶率分別為100％和15％。
　　 再次，PCR擴(kuò)增Ⅰ類(lèi)整合子基因盒插入序列，測(cè)序分析了其攜帶的耐藥基因盒。參照Du X D等人設(shè)計(jì)的Ⅰ類(lèi)整合子耐藥基因盒引物，對(duì)

4、20 株ESBL 整合子陽(yáng)性菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至Pmd-18T 載體多克隆位點(diǎn)構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒并測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果登錄GenBank 并進(jìn)行BLAST分析，確認(rèn)耐藥基因盒種類(lèi)。結(jié)果顯示20 株受試菌中有8 株細(xì)菌擴(kuò)增出2 種不同的基因盒插入序列，其中JD4 菌株攜帶的Ⅰ類(lèi)整合子基因盒插入序列長(zhǎng)約2315bp，其余7 株細(xì)菌Ⅰ類(lèi)整合子基因盒插入序列長(zhǎng)約2065bp。兩種大小不同的插入基因盒主要含有二氫葉酸還原酶和氨基糖腺苷轉(zhuǎn)

5、移酶兩種耐藥基因，使細(xì)菌呈現(xiàn)對(duì)甲氧磺胺嘧啶類(lèi)及氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物的耐藥性。
　　 最后，對(duì)ESBLs、整合子與細(xì)菌耐藥表型三者間相關(guān)性進(jìn)行了分析。采用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定臨床分離的69株致病菌的耐藥性，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較分析ESBLs整合子陽(yáng)性菌株與陰性菌株之間、攜帶耐藥基因盒的ESBLs整合子陽(yáng)性菌株與不攜帶耐藥基因盒的ESBLs整合子陽(yáng)性菌株之間的耐藥率有無(wú)差異。結(jié)果顯示ESBLs整合子陽(yáng)性菌株的耐藥率明顯高于非ESBL

6、s整合子陰性菌株，二者呈明顯差異性（P<0.01），但攜帶耐藥基因盒的ESBLs整合子陽(yáng)性菌株與不攜帶耐藥基因盒的整合子陽(yáng)性菌株的耐藥率無(wú)明顯差異性。
　　 綜上所述，本研究從臨床分離的69株致病菌中篩選鑒定到20株ESBLs陽(yáng)性菌株。受試ESBLs陽(yáng)性菌株中Ⅰ和Ⅱ類(lèi)整合子的攜帶率分別為100％和15％。ESBLs整合子陽(yáng)性菌株的耐藥率明顯高于非ESBLs整合子陰性菌株，但攜帶耐藥基因盒的ESBLs整合子陽(yáng)性菌株與不攜帶耐藥基因