中國大蒜遺傳多樣性評價及大蒜辣素含量與蒜氨酸酶基因的關(guān)聯(lián)分析.pdf

1、大蒜(Allium satiwum L.)為百合科(Liliaceae)蔥屬(Allium)重要的蔬菜兼藥用植物。中國是世界上最大的大蒜生產(chǎn)國和出口國。然而,我國大蒜研究基礎(chǔ)薄弱,對種質(zhì)資源遺傳背景和群體遺傳結(jié)構(gòu)尚不明確；無性繁殖大蒜不能人工雜交構(gòu)建常規(guī)作圖群體的難題也阻礙了大蒜辣素等重要性狀相關(guān)基因的挖掘。隨著國際市場對大蒜商品品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì),尤其對大蒜辣素含量要求的提高,迫切需要開展相關(guān)方面研究,以促進我國大蒜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,保持

2、我國在大蒜國際貿(mào)易上的優(yōu)勢。
　　 本文通過對我國大蒜種質(zhì)資源表型性狀及AFLP、SSR和InDel三種分子標記鑒定數(shù)據(jù)的分析,明確了我國大蒜資源遺傳背景和群體遺傳結(jié)構(gòu),為關(guān)聯(lián)作圖奠定了理論基礎(chǔ)；建立了大蒜辣素的超高效液相色譜(UPLC)檢測技術(shù)體系,對212份資源大蒜辣素含量進行了檢測；通過TAIL,-PCR、RT-PCR技術(shù)獲得了大蒜辣素合成途徑中的關(guān)鍵基因.蒜氨酸酶基因的編碼區(qū),對其結(jié)構(gòu)和基因多樣性進行了分析；根據(jù)蒜氨酸酶

3、基因內(nèi)含子2序列開發(fā)了一個InDel標記,并對其與大蒜辣素含量的關(guān)聯(lián)性進行了探討。主要結(jié)果如下:
　　 1.我國大蒜種質(zhì)資源的表型多樣性與分類。對資源圃保存的212份大蒜種質(zhì)資源的表型性狀進行了系統(tǒng)鑒定,統(tǒng)計分析表明我國大蒜種質(zhì)資源在表型變異很大,據(jù)此提出了21個數(shù)量性狀的5級分級標準。為了避免質(zhì)量性狀在種質(zhì)評價中的主導作用,對與產(chǎn)量相關(guān)的鱗莖數(shù)量性狀進行了重點分析,結(jié)果表明,構(gòu)成產(chǎn)量的數(shù)量性狀均表現(xiàn)較大變異。主成分分析顯示,前

4、三個主成分累積貢獻率達74.83％,第一主成分中鱗莖重、鱗莖直徑和鱗芽數(shù)是影響產(chǎn)量的主要因子。鱗莖重和鱗莖直徑與產(chǎn)量相關(guān)性最大。通過主坐標排序,將所有資源分為6類。通過綜合評價,將大蒜鱗莖產(chǎn)量分為6個級別,篩選出單產(chǎn)大于15×103 kg ha-1的資源3份。
　　 2.基于AFLP、SSR和InDel標記的大蒜種質(zhì)資源群體遺傳結(jié)構(gòu)和聚類分析。利用三種分子標記技術(shù)在212份種質(zhì)中擴增出502個位點,多態(tài)性位點為492個。群體遺傳

5、結(jié)構(gòu)與聚類分析均將所有資源劃分為5個類群體。劃分的類別基本一致。然而,群體遺傳結(jié)構(gòu)分析劃分的5個群體,群體內(nèi)的遺傳信息多樣性指數(shù)較小。對212份種質(zhì)鱗莖大蒜辣素和21個數(shù)量性狀與群體遺傳結(jié)構(gòu)進行線型模型分析,結(jié)果表明包括大蒜辣素含量在內(nèi)的多個數(shù)量性狀受群體遺傳結(jié)構(gòu)的影響較小,說明我國資源圃中保存的大蒜種質(zhì)資源遺傳背景豐富,適合進行相關(guān)分子標記與表型性狀的關(guān)聯(lián)作圖分析。
　　 3.大蒜辣素超高效液相色譜(UPLC)檢測技術(shù)體系的建

6、立和應(yīng)用。通過對樣品處理、提取方法和檢測方法的研究,首次建立了完善的大蒜辣素超高效液相色譜(UPLC)檢測方法:使用UPLCBEHC18色譜柱,流動相為甲醇:水=1:1,檢測波長為254nm,進樣體積為1 uL,流速為0.3mL min-1。大蒜辣素在2.04～510mg L-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(R2=0.9991)。研究了大蒜辣素水提取液對酸堿溶液、溫度及光照的穩(wěn)定性,結(jié)果顯示大蒜辣素對溫度和強酸強堿敏感,對光照不敏感。在室溫下,

7、大蒜辣素在pH=6.0左右時較穩(wěn)定,5d內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯降解。但在pH低于1.5或高于11.0的強酸或強堿條件下,大蒜辣素降解迅速。當溫度高于40℃時,降解速度加快,高于70℃時降解明顯加速。提取液濃度較高,穩(wěn)定性便較強。利用建立的方法對212份大蒜鱗莖的大蒜辣素含量進行檢測,發(fā)現(xiàn)資源圃中大蒜資源的大蒜辣素含量差異顯著,含量分布在0.82～3.01％之間,最高值與最低值相差近4倍。大蒜辣素含量與植株對蒜蛆抗性的關(guān)系分析表明,大蒜辣素含量越高

8、,大蒜對蒜蛆的抗性越強,進一步說明了大蒜辣素抗菌、殺蟲的生物活性。
　　 4.蒜氨酸酶基因編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)變異與品種演化分析。通過TAIL-PCR、RT-PCR技術(shù)獲得蒜氨酸酶基因編碼區(qū),從基因組水平及cDNA水平上研究了大蒜蒜氨酶基因編碼區(qū)的基因結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)蒜氨酸酶基因家族基因結(jié)構(gòu)復雜,由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成。內(nèi)含子差異明顯,外顯子相對保守。4個內(nèi)含子長度和序列均有較大差異,存在很多InDel和重復序列。其中內(nèi)含子2多樣性最大

9、,而在外顯子1、3和5發(fā)現(xiàn)了InDel現(xiàn)象和單個堿基變異。通過對外顯子和內(nèi)含子分析,將蒜氨酸酶基因家族編碼區(qū)劃分為10個基因模式。其中內(nèi)含子2包括了所有基因模式。對來源不同的3份大蒜資源E1,GH1和CN313(E1來自烏孜別克的野生資源,GH1來自美國,CN313來自的中國)的蒜氨酸酶基因的基因組序列進行聚類分析,在一定程度上證明了大蒜起源于中亞,而后逐漸向西方傳播,最后傳入東方的觀點。
　　 5.InDel標記的開發(fā)和應(yīng)用。

10、基于不同種質(zhì)蒜氨酸酶基因內(nèi)含子2序列,首次開發(fā)了InDel標記,并對212份大蒜種質(zhì)進行了檢測,在所有資源中共檢測到10個基因位點,多態(tài)性為100％?；贗nDel標記將212份大蒜劃分為5類,說明開發(fā)的蒜氨酸酶基因InDel標記對資源遺傳多樣性及分類具有研究價值。
　　 6.大蒜辣素含量與蒜氨酸酶基因變異的關(guān)聯(lián)分析。首次對大蒜分子標記(InDel標記)和表現(xiàn)型(大蒜辣素含量)的相互關(guān)系進行了研究,結(jié)果表明,InDel基因型不同