甘藍(lán)類蔬菜的細(xì)胞質(zhì)DNA多樣性研究.pdf

1、甘藍(lán)類蔬菜(Brassica oleracea L.)屬于十字花科蕓薹屬,包含結(jié)球甘藍(lán)、青花菜、花椰菜、球莖甘藍(lán)、芥藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、抱子甘藍(lán)等七個(gè)栽培變種。2006年全國(guó)結(jié)球甘藍(lán)(Brassicaoleracea var.capitata L.)的種植面積達(dá)93.73萬(wàn)公頃。結(jié)球甘藍(lán)雜交種的生產(chǎn)主要利用自交不親和系和雄性不育系兩種途徑,其中雄性不育系包括顯性核基因雄性不育(DGMS)和改良的Ogura蘿卜胞質(zhì)不育(CMS)。但雄性不育系的

2、利用存在胞質(zhì)單一的風(fēng)險(xiǎn)。從分子水平研究甘藍(lán)變種間和變種內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)DNA多態(tài)性,為顯性雄性不育系和胞質(zhì)不育系的胞質(zhì)多樣化提供科學(xué)依據(jù),而且對(duì)于闡明甘藍(lán)各變種的進(jìn)化路線具有重要意義。
　　 本研究利用甘藍(lán)類蔬菜不同變種間和變種內(nèi)材料,以開發(fā)的葉綠體SSR(cpSSR)和線粒體SSR(mtSSR)引物進(jìn)行多態(tài)性篩選；利用全基因組重測(cè)序結(jié)果,全面揭示六份結(jié)球甘藍(lán)材料間的細(xì)胞質(zhì)DNA多樣性；以獲得的特異SNP或CAPS標(biāo)記進(jìn)行Ogura

3、CMS不育系或DGMS不育系胞質(zhì)多樣性的驗(yàn)證。研究結(jié)果如下:
　　 1.利用已公布的擬南芥葉綠體、油菜線粒體全基因組序列,首次開發(fā)出可在結(jié)球甘藍(lán)上應(yīng)用的cpSSR和mtSSR引物。分別搜索獲得89個(gè)葉綠體基因組SSRs(cpSSRs)、29個(gè)線粒體基因組SSRs(mtSSRs),SSR出現(xiàn)頻率分別為1.736 kb／1個(gè)SSR、7.650 kb／1個(gè)SSR。針對(duì)這些SSR設(shè)計(jì)cpSSR引物58對(duì)、mtSSR引物21對(duì),能在結(jié)球甘

4、藍(lán)上應(yīng)用的cpSSR引物32對(duì)、mtSSR引物2l對(duì)。在32對(duì)cpSSR引物中,5對(duì)引物在結(jié)球甘藍(lán)自交系C300、C322和波里馬油菜N478、N479間有擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性,這些多態(tài)性片段均位于基因內(nèi)含子區(qū)或基因間隔區(qū)。多態(tài)性片段測(cè)序結(jié)果顯示單核苷酸A／T重復(fù)數(shù)從8個(gè)到13個(gè)不等,相似性比較表明C300、N479間的相似性大于兩者與擬南芥之間的相似性。21對(duì)mtSSR引物均未在甘藍(lán)C300、C322和波里馬油菜N478、N479間檢測(cè)到多

5、態(tài)性,表明線粒體DNA的保守程度比葉綠體要高。這些細(xì)胞質(zhì)SSR引物在結(jié)球甘藍(lán)上的成功應(yīng)用,為甘藍(lán)類蔬菜細(xì)胞質(zhì)多樣性研究提供了基礎(chǔ)。
　　 2.利用開發(fā)的cpSSR引物進(jìn)行甘藍(lán)類蔬菜不同變種間細(xì)胞質(zhì)DNA多態(tài)性篩選,首次獲得了具有變種特異性的葉綠體單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記,并成功將其轉(zhuǎn)化為dCAPS標(biāo)記。以32對(duì)在結(jié)球甘藍(lán)上應(yīng)用的cpSSR引物對(duì)結(jié)球甘藍(lán)、青花菜、花椰菜、芥藍(lán)、球莖甘藍(lán)等5個(gè)不同變種進(jìn)行標(biāo)記篩選,在聚丙烯酰胺凝

6、膠電泳上沒(méi)有獲得擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度多態(tài)性。對(duì)這32對(duì)引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,利用DNAstar軟件比對(duì)發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn),該位點(diǎn)初步呈現(xiàn)變種特異性。為簡(jiǎn)便快速鑒定該SNP位點(diǎn),將其成功轉(zhuǎn)化為衍生的酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(dCAPS)標(biāo)記-ACP43-93 RsaⅠ。以該dCAPS標(biāo)記對(duì)甘藍(lán)類蔬菜不同變種的206份材料進(jìn)行篩選,進(jìn)一步驗(yàn)證了該標(biāo)記的變種特異性。全部花椰菜和大部分青花菜為同一單元型,其它甘藍(lán)變種為另一單元型,由此推測(cè)青花菜和花椰

7、菜的分化時(shí)間相對(duì)較晚。同時(shí),利用三個(gè)甘藍(lán)變種的雄性不育回交群體明確了該葉綠體SNP為母性遺傳標(biāo)記。
　　 3.采用Solexa基因組重測(cè)序方法,以結(jié)球甘藍(lán)02-12新組裝的葉綠體和線粒體基因組全長(zhǎng)序列為參考,全面揭示六份結(jié)球甘藍(lán)材料(Ogura CMS R1、R2、R3、自交系60Tian、87-534、DGMS87—534)的葉綠體、線粒體基因組DNA序列多態(tài)性。與02-12相比,異源胞質(zhì)雄性不育材料Ogura CMS R1、

8、R2、R3在葉綠體基因組水平上的SNP個(gè)數(shù)分別為1010、357、62,在線粒體基因組水平上的SNP個(gè)數(shù)分別是630、599、108,這些不育系的SNP數(shù)量在Ogura CMS R1、R2、R3中呈現(xiàn)逐步減少的趨勢(shì),表明異源胞質(zhì)含量越少,胞質(zhì)不育系的應(yīng)用前景就好。與結(jié)球甘藍(lán)自交系Bo-1相比,Ogura CMS R3特有的9個(gè)葉綠體SNPs、49個(gè)線粒體SNPs、3個(gè)線粒體插入和缺失變異(InDels),將為今后Ogura胞質(zhì)不育系的進(jìn)

9、一步改良提供有效的篩選標(biāo)記。在三份結(jié)球甘藍(lán)材料B0-1、Bo-7、Bo-8中,各自特有的葉綠體SNP個(gè)數(shù)分別為4、21、0,線粒體SNP個(gè)數(shù)分別為9、18、2,特有的線粒體InDels個(gè)數(shù)分別為0、3、0,表明結(jié)球甘藍(lán)變種內(nèi)材料間具有細(xì)胞質(zhì)多樣性,為DGMS不育系的胞質(zhì)多樣化提供依據(jù)。
　　 4.以開發(fā)的32對(duì)cpSSR和21對(duì)mtSSR引物,對(duì)兩種可實(shí)用的結(jié)球甘藍(lán)Ogura CMS不育源CMS R3、CMS HY進(jìn)行分子鑒別,

10、發(fā)現(xiàn)了在可實(shí)用Ogura胞質(zhì)不育源中的胞質(zhì)多樣性。在cpSSR水平上,無(wú)法在聚丙烯酰胺凝膠電泳上獲得多態(tài)性,經(jīng)測(cè)序僅發(fā)現(xiàn)兩種不育源在ACP9引物上存在SSR重復(fù)數(shù)的變異。在mtSSR水平上,僅mtSSR2引物可以在聚丙烯酰胺凝膠電泳上區(qū)分這兩種不育源,經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)其余5對(duì)mtSSR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物上存在9個(gè)多態(tài)性差異,其中3個(gè)為SSR位點(diǎn)重復(fù)數(shù)的變異。將其中2個(gè)可被MseⅠ酶切的多態(tài)性位點(diǎn)轉(zhuǎn)化成CAPS標(biāo)記,分別命名為m92-143 Mse

11、Ⅰ、m1-346MseⅠ。這些標(biāo)記表明CMS HY是一種不同于CMS R3的改良結(jié)球甘藍(lán)Ogura CMS雄性不育源。以CMS HY為不育源進(jìn)行3個(gè)優(yōu)良結(jié)球甘藍(lán)自交系的轉(zhuǎn)育,現(xiàn)已獲得回交6代、花器官正常、結(jié)實(shí)性良好的優(yōu)良雄性不育系。因此通過(guò)鑒別兩種可實(shí)用的Ogura CMS不育源,發(fā)現(xiàn)了在可實(shí)用Ogum胞質(zhì)不育源中的胞質(zhì)多樣性。
　　 5.采用微量花粉回交法,成功獲得替換胞質(zhì)的DGMS-T不育系四份,并進(jìn)行了胞質(zhì)來(lái)源鑒定。以結(jié)球

12、甘藍(lán)DGMS不育系微量花粉為父本,以不育系相應(yīng)保持系為母本,雜交后獲得了四份DGMS-T不育系—07-556、07-1005、07-1006、07-1007。田間鑒定表明在DGMS不育系的不育性遺傳、不育穩(wěn)定性、花器官形態(tài)、結(jié)實(shí)性、田間植株性狀等方面,胞質(zhì)替換前后并沒(méi)有顯著性差異。以DGMS不育源79-399-3及回交父本60Tian間特有的SNP標(biāo)記和CAPS標(biāo)記,驗(yàn)證了不育系DGMS—T60Tian的胞質(zhì)來(lái)源為其回交父本。總之,本研