通過遠(yuǎn)緣雜交創(chuàng)制甘藍(lán)Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育的恢復(fù)材料.pdf

1、甘藍(lán)類蔬菜(Brassica oleraceaL.)是一類重要的蕓薹屬蔬菜，在全世界范圍內(nèi)廣泛種植，其雜種優(yōu)勢(shì)十分明顯。Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育（Ogura CMS）的不育性穩(wěn)定，轉(zhuǎn)育容易，是十字花科作物雜種優(yōu)勢(shì)利用的主要途徑之一，近十年來也越來越多地用于甘藍(lán)類蔬菜雜交種種子的生產(chǎn)。但Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育是母性遺傳，所有后代均是雄性不育，無法自交分離，不利于種質(zhì)資源的創(chuàng)新、利用。解決這一問題的有效方法是挖掘或創(chuàng)制Ogura CMS恢

2、復(fù)系。此外，Ogura CMS恢復(fù)系的創(chuàng)制對(duì)于打破國(guó)外公司對(duì)特有資源的壟斷也具有重要意義。然而，迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)在甘藍(lán)類蔬菜中存在Ogura CMS恢復(fù)系，因此，迫切需要從其他作物中導(dǎo)入恢復(fù)基因，創(chuàng)制出甘藍(lán)類蔬菜中OguraCMS恢復(fù)系。
　　目前甘藍(lán)型油菜Ogura CMS恢復(fù)系已經(jīng)成功創(chuàng)制并用于雜交種生產(chǎn)，為了獲得甘藍(lán)類蔬菜中Ogura CMS恢復(fù)材料，本研究中利用芥藍(lán)和甘藍(lán)型油菜恢復(fù)系進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，結(jié)合胚挽救手段，將甘藍(lán)型

3、油菜Rfo育性恢復(fù)基因?qū)氲浇嫠{(lán)中;利用分子標(biāo)記對(duì)種間雜種進(jìn)行前景和背景篩選，獲得育性恢復(fù)的雜種后代;此外還對(duì)遠(yuǎn)緣雜交種胚挽救時(shí)期選擇，種間雜種的形態(tài)特征、倍性、育性表現(xiàn)等進(jìn)行了觀察和分析。主要結(jié)果如下:
　　1.獲得了Ogura CMS芥藍(lán)和甘藍(lán)型油菜恢復(fù)系的種間雜種，明確了胚挽救的最佳時(shí)期。利用蕾期授粉結(jié)合胚挽救手段獲得了9株Ogura CMS芥藍(lán)和甘藍(lán)型油菜的種間雜種，其中利用胚挽救手段獲得6株，雜種獲得率為2.5％;而常規(guī)

4、授粉方法（無胚挽救）僅獲得3株，雜種獲得率為0.05％，與常規(guī)授粉（無胚挽救）方式相比，胚挽救手段可以有效克服遠(yuǎn)緣雜交間的生殖障礙，提高遠(yuǎn)緣雜交的結(jié)實(shí)率。9株種間雜種與生長(zhǎng)勢(shì)相關(guān)的形態(tài)特征呈現(xiàn)超親優(yōu)勢(shì)，其余大多數(shù)植株形態(tài)特征介于雙親之間;DNA相對(duì)含量介于雙親之間，為三倍體植株。對(duì)不同離體時(shí)期胚挽救成功率進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，授粉后10天取子房進(jìn)行離體培養(yǎng)，10天后再剝胚培養(yǎng)為胚挽救最佳時(shí)期，過早進(jìn)行胚挽救成活率低，過晚則大部分胚已開始敗育。

5、
　　2.首次獲得7株育性恢復(fù)的Ogura CMS芥藍(lán)和甘藍(lán)型油菜種間雜種，并新開發(fā)出用于種間雜種前景選擇的Rfo序列特異分子標(biāo)記。鑒于前人根據(jù)甘藍(lán)型油菜設(shè)計(jì)開發(fā)的Rfo特異性分子標(biāo)記在甘藍(lán)中存在非特異性擴(kuò)增，無法用于甘藍(lán)育性恢復(fù)后代的篩選。通過比對(duì)蕓薹屬數(shù)據(jù)庫(kù)和甘藍(lán)重測(cè)序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在甘藍(lán)類蔬菜中存在Rfo同源序列，序列間一致性超過89％。通過克隆測(cè)序，新開發(fā)了一對(duì)可用于甘藍(lán)育性恢復(fù)單株篩選的Rfo序列特異分子標(biāo)記(BnRFO-A

6、S2F/BnRFO-NEW-R)。利用新設(shè)計(jì)開發(fā)的Rfo特異性分子標(biāo)記對(duì)9株種間雜種進(jìn)行篩選，7株為Rfo陽(yáng)性。進(jìn)一步對(duì)其育性觀察發(fā)現(xiàn)，7株Rfo陽(yáng)性單株育性均得到恢復(fù)，其余不含Rfo特異標(biāo)記的2個(gè)單株均沒有出現(xiàn)花粉。由此表明該標(biāo)記可以作為Rfo基因的特異性標(biāo)記，用于甘藍(lán)育性恢復(fù)單株的篩選。在開花期，對(duì)7株Rfo陽(yáng)性單株的花粉量和花粉活力進(jìn)行比較，結(jié)果顯示YL2和YL6育性恢復(fù)情況較好，在各個(gè)開花時(shí)期均優(yōu)于其余單株;同一單株在不同開花時(shí)

7、期育性情況也具有顯著差異，開花后前12天育性較好，后期各單株的花粉量和花粉活力顯著下降。
　　3.對(duì)種間雜種回交后代進(jìn)行前景和背景選擇，快速篩選出既包含Rfo基因、遺傳背景又與芥藍(lán)更為接近的BC1代單株。為消除油菜染色體背景，對(duì)F1代Rfo陽(yáng)性單株中育性恢復(fù)較好的單株YL2和YL6進(jìn)行自交和回交授粉。YL2的三倍體植株自交授粉未獲得F2代種子。秋水仙素加倍后獲得1株六倍體植株(YL2-3)，育性較好，可自交結(jié)實(shí)。F2代植株性狀分離

8、明顯，形態(tài)學(xué)性狀總體偏向甘藍(lán)型油菜，所有植株都含有Rfo基因且均育性恢復(fù)。以CMS芥藍(lán)為母本，YL2，YL2-3，YL6為父本進(jìn)行回交，共獲得35株BC1代種間雜種。利用新開發(fā)的Rfo序列特異引物(BnRFO-AS2F/BnRFO-NEW-R)進(jìn)行前景篩選，29株含有Rfo基因。育性觀察發(fā)現(xiàn)，29株Rfo陽(yáng)性植株均表現(xiàn)為可育，有花粉出現(xiàn)，但不同單株花粉飽滿程度不同。利用33對(duì)多態(tài)性SSR引物雜種后代植株進(jìn)行遺傳背景篩選，F(xiàn)1代植株的遺傳