局部性促生長(zhǎng)因子對(duì)雞卵泡發(fā)育的調(diào)控及其機(jī)理的研究.pdf

1、目前，人們的消費(fèi)和市場(chǎng)走向迫使家禽業(yè)在蛋禽育種時(shí)，選留具有高繁殖性能的個(gè)體，而母禽的繁殖性能特別是產(chǎn)蛋率的高低主要取決于卵泡的發(fā)育狀況。因此，家禽卵泡發(fā)育的研究成為了解禽類繁殖機(jī)能調(diào)控和提高家禽產(chǎn)蛋性能的理論基礎(chǔ)。此外，家禽卵泡以其獨(dú)特的特征優(yōu)勢(shì)成為研究卵巢和卵泡發(fā)育理想的生物學(xué)模型。大量的研究表明，家禽卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育和成熟是在一系列激素和生長(zhǎng)因子的精確調(diào)控下進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)以雞為研究對(duì)象，一方面研究了雞卵巢發(fā)育過(guò)程中一系列形態(tài)變化，另一方

2、面研究了表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growthfactor，EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)及Ghrelin對(duì)產(chǎn)蛋雞小黃卵泡顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞及18日胚齡雞胚卵巢生殖細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控及其機(jī)制，為提高家禽繁殖性能提供理論依據(jù)。
　　 1.產(chǎn)蛋雞卵泡發(fā)育的組織學(xué)研究
　　 家禽卵泡發(fā)育是一

3、個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，伴隨著形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。組織結(jié)構(gòu)決定其生理功能，因此，卵泡發(fā)育形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究有助于家禽卵泡發(fā)育調(diào)控機(jī)理的研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)組織學(xué)方法研究雞卵泡發(fā)生發(fā)育過(guò)程中的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果表明：孵化至第6天，原始生殖細(xì)胞已經(jīng)遷移到生殖嵴，并與生殖嵴共同形成未分化的性腺；孵化至第9天，性腺已經(jīng)分化，卵巢特征性結(jié)構(gòu)開(kāi)始出現(xiàn)，胚胎后期卵巢皮質(zhì)內(nèi)卵母細(xì)胞聚集成簇。原始卵泡的發(fā)育在出生以后開(kāi)始啟動(dòng)，性成熟母雞的卵泡呈等級(jí)發(fā)育，顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞在形

4、態(tài)和增殖特性上具有等級(jí)階段特異性。以上結(jié)果表明，家禽卵泡發(fā)育是一個(gè)以形態(tài)變化為特征的生長(zhǎng)過(guò)程，由卵母細(xì)胞的成熟和卵泡細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育兩部分構(gòu)成。
　　 2.表皮生長(zhǎng)因子對(duì)雞等級(jí)前卵泡發(fā)育的影響
　　 家禽卵巢卵泡的選擇受內(nèi)/自/旁分泌因子的影響，由復(fù)雜的循環(huán)激素和局部因子綜合調(diào)控。促卵泡素(FSH)和EGF在家禽卵泡發(fā)育過(guò)程中起決定性作用，具有代表性意義，兩者作用的機(jī)制及其互作方式值得深入研究。本實(shí)驗(yàn)旨在研究EGF對(duì)產(chǎn)蛋雞

5、等級(jí)前卵泡發(fā)育的調(diào)節(jié)作用。EGF及其受體(EGFR)mRNA在雞等級(jí)前卵泡高度表達(dá)，包括大白卵泡(LWF)和小黃卵泡(SYF)，然后隨著卵泡的發(fā)育逐漸降低。體外懸浮培養(yǎng)的全卵泡經(jīng)EGF及FSH單獨(dú)或聯(lián)合處理24 h后，LWF和SYF的顆粒層和膜層厚度及顆粒細(xì)胞密度均顯著增加(P<0.05)，且以EGF與FSH聯(lián)合處理組最為顯著。EGF和FSH的處理可以提高卵泡中顆粒細(xì)胞的有絲分裂率。體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞經(jīng)0.1～100ng/ml的EGF或

6、FSH單獨(dú)處理24h后出現(xiàn)增殖現(xiàn)象，且增殖強(qiáng)度與劑量正相關(guān)。EGF或FSH可以顯著增加顆粒細(xì)胞核增殖抗原(PCNA)表達(dá)和抑制細(xì)胞凋亡(P<0.05)。EGF可以顯著增加EGFR、FSH受體(FSHR)和細(xì)胞周期調(diào)控蛋白(CCND1/CDK6和CCNE1/CDK2)mRNA的表達(dá)(P<0.05)，卻明顯下調(diào)促黃體激素受體(LHR)mRNA的表達(dá)(P<0.05)。EGF或FSH引起的顆粒細(xì)胞數(shù)目和PCNA-LI升高及凋亡發(fā)生率降低等效應(yīng)均

7、被EGFR抑制劑AG1478所拮抗。以上研究結(jié)果表明，EGF/EGFR在雞卵泡發(fā)育過(guò)程中表達(dá)具有階段特異性；EGF通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期及協(xié)同F(xiàn)SH而促進(jìn)雞等級(jí)前卵泡顆粒細(xì)胞的增殖，從而調(diào)節(jié)等級(jí)前卵泡的發(fā)育。
　　 3.堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)雞胚卵巢和等級(jí)前卵泡發(fā)育的影響
　　 bFGF是一種局部自分泌或旁分泌的有絲裂原，參與調(diào)節(jié)組織發(fā)育和細(xì)胞功能的不同過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)首先觀察bFGF的受體(FG

8、FR1)在雞胚卵巢和成年產(chǎn)蛋雞等級(jí)前小黃卵泡中的表達(dá)情況，然后觀察bFGF對(duì)雞胚卵巢生殖細(xì)胞和等級(jí)前卵泡顆粒細(xì)胞發(fā)育的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)GFR1在18日胚齡雞卵巢的皮質(zhì)和髓質(zhì)的細(xì)胞中廣泛表達(dá)，在雞小黃卵泡的顆粒層中強(qiáng)表達(dá)。在體外，bFGF(0.1～100 ng/ml)對(duì)雞胚卵巢生殖細(xì)胞和小黃卵泡顆粒細(xì)胞呈劑量依賴方式增殖，但這種增殖作用被FGFR1抑制劑(SU5402)顯著阻斷；蛋白激酶C(PKC)激活劑佛波酯(PMA)能顯著增強(qiáng)bFG

9、F(10 ng/ml)的促上述細(xì)胞增殖作用(P<0.05)，PKC抑制劑H7卻可以顯著抑制此作用(P<0.05)；而蛋白激酶A(PKA)激活劑佛司可林(FRSK)和PKA抑制劑H89對(duì)此作用沒(méi)有顯著影響。此外，向雞胚內(nèi)注射bFGF后對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了bFGF可以促進(jìn)雞胚卵巢生殖細(xì)胞的增殖。經(jīng)bFGF(10ng/ml)處理后，雞等級(jí)前小黃卵泡顆粒細(xì)胞細(xì)胞周期調(diào)控基因CCND1/CDK6和CCNE1/CDK2mRNA豐度顯著升高，

10、而H7可顯著抑制bFGF上調(diào)以上四種基因表達(dá)的作用。bFGF通過(guò)與細(xì)胞膜表面受體FGFR1結(jié)合，啟動(dòng)PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控細(xì)胞周期，發(fā)揮促細(xì)胞增殖作用，從而調(diào)節(jié)雞胚卵巢生殖細(xì)胞和等級(jí)前卵泡的發(fā)育。
　　 4.干細(xì)胞因子對(duì)雞等級(jí)前卵泡膜細(xì)胞增殖的影響
　　 SCF是最早發(fā)現(xiàn)的促進(jìn)卵泡募集的旁分泌因子，在卵巢中，主要由顆粒細(xì)胞表達(dá)，被譽(yù)為“膜細(xì)胞的組織者”，參與膜細(xì)胞的募集和分化。本文通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)和免疫組化方法探討SC

11、F對(duì)雞等級(jí)前卵泡膜細(xì)胞增殖作用及參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。雞小黃卵泡膜細(xì)胞在體外預(yù)培養(yǎng)16h后，經(jīng)SCF(0.1～100 ng/ml)處理24 h后膜細(xì)胞顯著增殖(P<0.05)，其凋亡發(fā)生率亦被顯著抑制，上述效應(yīng)呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。SCF處理可以增加膜細(xì)胞c-Kit的表達(dá)，同時(shí)SCF的促增殖作用被c-Kit抗體所抑制。向培養(yǎng)體系中添加PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活劑PMA或抑制劑H7后，SCF促膜細(xì)胞增殖作用將分別被顯著增強(qiáng)或抑制。PKA信號(hào)

12、轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活劑FRSK和抑制劑H89對(duì)SCF的促膜細(xì)胞增殖作用無(wú)明顯影響。以上結(jié)果表明，SCF通過(guò)與細(xì)胞表面c-Kit結(jié)合，在PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與下，發(fā)揮其促小黃卵泡膜細(xì)胞增殖的作用，從而調(diào)節(jié)等級(jí)前卵泡的發(fā)育。
　　 5.Ghrelin對(duì)雞等級(jí)前卵泡發(fā)育的影響
　　 Ghrelin是一種主要由胃腸道分泌產(chǎn)生的多肽，具有促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌、促進(jìn)攝食、參與能量代謝等多種生理作用。近年來(lái)研究表明，Ghrelin及其受體(GHS

13、R)在卵巢組織中的表達(dá)并在卵泡發(fā)育中起調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)旨在研究Ghrelin對(duì)產(chǎn)蛋雞等級(jí)前卵泡發(fā)育的調(diào)節(jié)作用。首先通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)卵泡GHSR的表達(dá)情況，然后利用全卵泡培養(yǎng)和顆粒細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)模型結(jié)合組織學(xué)和免疫組化方法探討了Ghrelin對(duì)雞等級(jí)前卵泡形態(tài)和顆粒細(xì)胞增殖的影響及相關(guān)機(jī)制。結(jié)果表明，GHSR mRNA在顆粒層和膜層上均有表達(dá)，其表達(dá)量隨著卵泡的發(fā)育先而逐漸上升，至LWF和SYF階段升至最高，隨后逐漸降低。懸浮培養(yǎng)的卵

14、泡經(jīng)100 ng/ml的Ghrelin處理24 h后，LWF和SYF的顆粒層和膜層厚度及顆粒細(xì)胞密度均顯著增加(P<0.05)。雞小黃卵泡的顆粒細(xì)胞在體外預(yù)培養(yǎng)12h后，用1～1000 ng/ml的Ghrelin處理24 h，細(xì)胞增殖效應(yīng)呈現(xiàn)出劑量依賴性。顆粒細(xì)胞經(jīng)100 ng/ml的Ghrelin處理后，PKA和PKC陽(yáng)性率顯著上升(P<0.05)；H89及H7能夠顯著抑制Ghrelin的促顆粒細(xì)胞增殖作用，而FRSK及PMA作用正好

15、與之相反。同時(shí)，體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)卵泡的顆粒細(xì)胞中層粘連蛋白(LN)和縫隙連接蛋白43(Cx43)的標(biāo)記率顯著提高(P<0.05)。上述結(jié)果提示，Ghrelin可通過(guò)PKA和PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和提高LN和Cx43的表達(dá)以增強(qiáng)顆粒細(xì)胞連接功能，促進(jìn)雞等級(jí)前卵泡顆粒細(xì)胞的增殖，從而調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育。
　　 總之，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)形態(tài)學(xué)和免疫組化方法研究了產(chǎn)蛋雞卵巢發(fā)育過(guò)程中卵泡形態(tài)學(xué)變化特點(diǎn)；通過(guò)將局部生長(zhǎng)因子(EGF、bFGF和S