甘藍SRK激酶結構域編碼區(qū)的克隆及其與MLPK的雙色FISH定位研究.pdf

1、蕓薹屬自交不親和性由S位點所控制。SRK基因是決定自交不親和性反應的關鍵因子，前人已經從蕓薹屬中的甘藍、甘藍型油菜等物種中克隆出SRK基因。SRK基因的變異和表達量都會影響自交不親和性。SRK基因的胞外域有著較大的多態(tài)性，變異常常發(fā)生在此編碼區(qū)。相對于胞外域，激酶結構域的保守型較強。本文專門對SRK基因激酶結構域進行了克隆分析，以期從進化的角度探討激酶結構域對于自交不親和性的作用。除此之外，MLPK被證明也是SI反應中必不可少的一個因子

2、，作為SRK下游元件起作用。本文針對這兩個基因在SI中的重要性，利用FISH技術將SRK和MLPK進行物理定位，從而探索其在甘藍基因組中的分布及其拷貝數(shù)。得到的主要研究結果如下：
　　 1.以結球甘藍263、羽衣甘藍AY627和甘藍型油菜S11為材料，采用PCR、RT-PCR等技術，分別對SRK激酶結構域基因組DNA和cDNA進行了擴增、測序和序列分析，并構建了分子進化樹。分別獲得了1694bp和1307bp的片段、1705bp

3、和1229bp的片段和1606bp和1214bp的片段，分別編碼433，407和402個氨基酸。對獲得的片段進行比對發(fā)現(xiàn)，結球甘藍263包括5個外顯子和4個內含子，羽衣甘藍AY627和甘藍型油菜S11包括6個外顯子和5個內含子。并且發(fā)現(xiàn)結球甘藍263的內含子少1個，并且有一段70bp左右的插入片段。對已報道的21種SRK基因和本文所克隆的3種材料的序列構建分子進化樹，發(fā)現(xiàn)三者都與S單倍型的Ⅰ類SRK基因聚在一起，Ⅱ類基因與Ⅰ類基因分為兩

4、支，擬南芥與Ⅱ類聚在一起，而蘿卜屬未形成單獨的一支。推導甘藍26370bp片段的插入有可能是內含子轉化而來并導致了自交不親和性的產生。羽衣甘藍AY627與甘藍型油菜S11所獲得的片段與預期一致，激酶結構域沒有發(fā)生片段的插入或缺失，推導導致甘藍型油菜S11自交不親和性的原因沒有發(fā)生在激酶結構域部分。通過進化樹飛分析推導出蘿卜屬與蕓薹屬的分離晚于SILKⅠ類和Ⅱ類的分離。
　　 2.在FISH過程中，對甘藍根尖前中期染色體和DNA纖

5、維的制片進行了一些條件的改變，試圖提高FISH效果。在前中期染色體制片中，本文對冷處理時間和酶解時間進行了改變，將冷處理時間定在20h，酶解時間定在90min，制得的染色體圖片前中期分裂相較多，并且粘連程度較低，背景也較干凈。在DNA纖維制片中，細胞核的提取過程中，控制研磨力度和加入TritonX-100的量進行了改變；DNA纖維制片時，改變了細胞核裂解液的裂解時間。通過以上改變，降低了纖維的纏繞程度。
　　 3.用經過以上改變