SVCV糖蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及SVCV和IHNV抗體庫的篩選.pdf

1、鯉春病毒血癥（Springviremiaofcarp，SVC）是一種由鯉春病毒血癥病毒（Springviremiaofcarpvirus，SVCV）引起的嚴(yán)重的傳染性急性流行病，主要影響鯉科魚類。傳染性造血器官壞死癥(InfectiousHematopoieticNecrosis，IHN)是一種北半球鮭魚科常見的傳染性急性病毒病，由傳染性造血器官壞死癥病毒（InfectiousHematopoieticNecrosisVirus，IHN

2、V）引起。SVCV和IHNV均屬于彈狀病毒科病毒。一旦發(fā)病，染病魚類死亡率高達(dá)70％-90％，對世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。SVCV糖蛋白是SVCV最主要抗原，并攜帶病毒中和表位，糖蛋白基因是研制基因工程抗體的候選基因。本研究利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中成功的表達(dá)了SVCVG基因，對深入研究SVCV糖蛋白的生物學(xué)活性具有重要意義。噬菌體抗體技術(shù)具有操作簡單，篩選周期短，并能獲得高親和力的特異性抗體等優(yōu)點(diǎn)。因此，噬菌體抗體展示技

3、術(shù)廣泛的應(yīng)用于抗體篩選。
　　本實(shí)驗(yàn)利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)SVCV糖蛋白。將SVCV糖蛋白基因(G)插入到質(zhì)粒pFastBacHTA中，再將構(gòu)建的質(zhì)粒pFastBac-G轉(zhuǎn)化E.coliDH10αBac感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，獲得含G基因的重組質(zhì)粒Bacmid-G。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)將Bacmid-G轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的SF9細(xì)胞，收獲轉(zhuǎn)染上清獲得重組桿狀病毒AcNPV-G。AcNPV-G感染Sf9細(xì)胞，超聲破碎后離心取上清進(jìn)行SDS

4、-PAGE及WesternBlot試驗(yàn)，結(jié)果顯示蛋白條帶大小約為57kDa，并能與羊抗SVCV血清發(fā)生特異性反應(yīng)。間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示在感染重組病毒的Sf9細(xì)胞中觀察到熒光信號(hào)。試驗(yàn)結(jié)果表明，SVCV糖蛋白在Sf9細(xì)胞中獲得成功地表達(dá)，且具有良好的免疫學(xué)活性。
　　應(yīng)用噬菌體抗體展示技術(shù)，經(jīng)過3輪富集篩選后從噬菌體抗體庫中獲得8株抗SVCV單鏈抗體(scFv)，且均為可溶性抗體。Dotblot分析結(jié)果表明，可溶性單鏈抗體能特異

5、性識(shí)別SVCV;Westernblot結(jié)果顯示單鏈抗體的分子量約為29kDa，8個(gè)抗體中僅P2H12能識(shí)別變性的SVCV。間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示8株單鏈抗體均能對染毒病灶產(chǎn)生特異性的熒光染色。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明單鏈抗體不與其他幾種病毒蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。
　　以純化的IHNV為抗原從噬菌體抗體庫中成功篩選到6株抗IHNV的單鏈抗體。Westernblot結(jié)果顯示單鏈抗體分子量大小約為32kDa。Dotblot結(jié)果表明6株單鏈抗體均