控制花生籽粒油酸含量相關(guān)基因的鑒定與分析.pdf

1、花生是重要的油料作物，它富含優(yōu)質(zhì)蛋白和脂肪，是人們健身增壽的食療保健佳品。花生籽粒油脂的品質(zhì)是由脂肪酸的組成決定的，高油酸的花生穩(wěn)定性好、營養(yǎng)價值高，越來越受到人們的喜愛。因而，提高油酸的相對含量，增加油酸/亞油酸(O/L)的比值，已成為目前油料作物育種的重要內(nèi)容，與此同時與油酸積累相關(guān)的兩個關(guān)鍵酶——硬脂酰ACP脫氫酶(stearoyl–acyl carrier protein(ACP) desaturase，SAD)和微粒體△12脂

2、肪酸脫氫酶(delta12 fatty acid desaturase，Δ12FAD或FAD2)引起了眾多研究者的關(guān)注。
　　SAD催化硬脂?；牡?-10碳原子間脫氫形成第一個雙鍵，產(chǎn)生油?；d體蛋白。它是油酸積累的關(guān)鍵酶，在決定植物飽和和不飽和脂肪酸的比例上起重要作用，它對植物的生理功能也有重要影響。本實驗利用同源克隆方法，從花生魯花14中克隆得到了兩個AhSAD基因，分別將它們命名為AhSAD1-1和AhSAD1-2.對Ah

3、SAD1基因的cDNA序列進行較系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，包括多序列比對、同源性分析、蛋白質(zhì)理化特性以及結(jié)構(gòu)預(yù)測與特征分析，結(jié)果表明AhSAD1和其它植物的SAD氨基酸序列間有很高的同源性，在所比較的SAD中，AhSAD1和它們的同源性都在73％以上。具功能的AhSAD1分子是一個同型二聚體，它在進化上較為保守，含一個屬于酰基ACP脫氫酶(Acyl-Acyl Carrier Protein Desaturase，AAD)家族和類鐵蛋白(Fe

4、rritin-1ike)家族的保守結(jié)構(gòu)域?；虮磉_模式分析顯示，AhSAD1在發(fā)育的種子中的表達量最高，且在果針入土50天后達到最高峰，結(jié)合花生種子發(fā)育過程中硬脂酸和油酸積累發(fā)展趨勢，說明該基因在調(diào)控脂肪酸積累和組成上具有重要作用。同時，為了進一步研究魯花14中兩種AhSAD1蛋白的具體功能，我們構(gòu)建了CaMV35S啟動子驅(qū)動的過量表達AhSAD1基因的植物過量表達載體 pCAMBIA3301-35S-AhSAD1-1和pCAMBIA3

5、301-35S-AhSAD1-2.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別將它們導(dǎo)入擬南芥、煙草、花生，經(jīng)檢測證明，該基因已經(jīng)成功整合入煙草、花生基因組中，為進一步選育性狀優(yōu)良的高油酸花生品種奠定了基礎(chǔ)。
　　FAD2催化油酸在碳12位上脫氫生成亞油酸，是控制籽粒油酸、亞油酸含量和O/L比值的關(guān)鍵酶。為了深入了解控制花生O/L比值的遺傳基礎(chǔ)，提高花生品質(zhì)育種效率，本實驗室對魯花14等13個花生栽培品種Δ12脂肪酸脫氫酶AhFAD2基因的編碼區(qū)進行了序

6、列分析。結(jié)果表明:該基因在13個花生品種中皆存在3類轉(zhuǎn)錄本:即AhFAD2A、AhFAD2B和AhFAD2C。臨桂麻殼、飛龍鄉(xiāng)、勾了種、魯花14、花育19、花育23這些品種在AhFAD2A基因448位點存在G→A點突變，該突變導(dǎo)致編碼酶活幾盡喪失，魯花11在此位點為G/A雜合，除此之外AhFAD2A基因在某些品種的其他8個位點也存在多態(tài)性。AhFAD2B基因相對保守，所測13個花生品種的核苷酸序列基本相同；AhFAD2C基因的G451T

7、點突變，形成TAA終止子；或674~680 bp之間7 bp的片段插入，導(dǎo)致移碼，形成TGA終止子，使得AhFAD2C不能編碼完整蛋白，為假基因。OL1編碼具有活性的AhFAD2A脫氫酶，OL2編碼AhFAD2B脫氫酶。ol1是AhFAD2A的一個突變等位基因；ol2是AhFAD2B的隱性等位基因。故我們認為，臺山珍珠、臺山三粒肉、江田種、Chico、05-21063、白沙1016的基因型是OL1OL1OL2OL2；臨桂麻殼、飛龍鄉(xiāng)、勾

8、了種、魯花14、花育19、花育23的基因型是ol1ol1OL2OL2；魯花11的基因型可能存在OL1ol1雜合等位位點。結(jié)合對這些品種籽粒中脂肪酸的組分氣相色譜分析發(fā)現(xiàn)，籽粒O/L比值大于1.5的品種臨桂麻殼、勾了種、魯花11、魯花14、花育19、花育23 AhFAD2A基因在448位點也存在G→A點突變，這表明AhFAD2A基因G448A點突變是造成花生品種籽粒的O/L比值相對提高的因素之一。本研究同時對假基因可能存在的功能進行了討論