擬南芥CBF3基因轉(zhuǎn)化文心蘭的研究.pdf

1、本研究以文心蘭為試驗(yàn)材料,優(yōu)化了文心蘭的再生體系。試驗(yàn)結(jié)果表明:文心蘭原球莖在激素配比為MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L+2％(W/V)蔗糖+0.6％(WN)瓊脂的培養(yǎng)基上,經(jīng)過25d后可增殖形成大量原球莖,30d左右繼代1次,繼代原球莖增殖倍數(shù)約為4。原球莖材料經(jīng)培養(yǎng)累積到一定量時(shí),將所得的原球莖切塊接種到激素配比為MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+5％(V/V)椰子水+2％(W/V)蔗糖+0.6％

2、(W/V)瓊脂的培養(yǎng)基上,有利于不定芽的分化。帶叢生芽的組織塊接種在1/2MS+IBA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+10％(V/V)椰子水+2％(W/V)蔗糖+0.6％(W/V)瓊脂培養(yǎng)基上,15d后生根;25d后小苗基部可分化出長1cm左右的根,生根率達(dá)95％。
　　 通過基因槍法和農(nóng)桿菌法分別轉(zhuǎn)化進(jìn)行文心蘭的轉(zhuǎn)基因研究。
　　 測定了原球莖對Hyg的抗性。以抗寒基因CBF3為目的基因,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化法

3、,研究了預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間對農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化率的影響試驗(yàn)。結(jié)果表明:原球莖對Hyg的敏感濃度為30mg/L、預(yù)培養(yǎng)1d、農(nóng)桿菌侵染原球莖最適時(shí)間為15min、共培養(yǎng)時(shí)間為2d有利于轉(zhuǎn)化率的提高。受體材料接種到MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Carb400mg/L培養(yǎng)基上進(jìn)行脫菌培養(yǎng),15-20d繼代一次。2代后,轉(zhuǎn)接到MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+5％(V/V)椰子水+Hyg30mg

4、/L培養(yǎng)基中進(jìn)行抗性篩選。
　　 通過基因槍法進(jìn)行轉(zhuǎn)化,研究預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化的影響,結(jié)果表明:最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為1d,最佳射程為6cm。延長培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)入MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+5％(V/V)椰子水+Hyg30mg/L培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選。
　　 對所獲得的轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行了PCR檢測及Southern印跡雜交鑒定。選取抗性植株進(jìn)行PCR檢測,發(fā)現(xiàn)經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的有5株呈陽性,將其擴(kuò)繁,進(jìn)行PCR檢