氮素對羽葉決明單寧含量的影響及DFR基因的克隆.pdf

1、羽葉決明(Chamaecristanictitans)是一種豆科決明屬、熱帶多年生牧草,具有明顯的耐瘠、耐酸、抗旱性強(qiáng)等特點(diǎn),目前在福建、江西、湖南等地得到廣泛種植,廣泛用于紅壤改良、水土保持和畜牧養(yǎng)殖。羽葉決明在初花期的養(yǎng)分含量最高,其粗蛋白含量達(dá)15.9％。但由于含有較高的縮合單寧含量,影響了羽葉決明的畜牧利用。
　　 本研究設(shè)計0、15、30、45、60、75、90mg/kg·N7個氮素梯度處理(分別用CK、處理A、B、C

2、、D、E、F表示),測定羽葉決明初花期時莖、葉組織中的縮合單寧含量,探索氮素對羽葉決明縮合單寧含量的影響;同時測定控制縮合單寧合成的關(guān)鍵酶二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)的活性;并對DFR基因進(jìn)行了克隆,檢測不同處理、不同組織中DFR基因的表達(dá)情況,以深入了解牧草中縮合單寧的合成機(jī)制,為人為調(diào)控提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:
　　 1、采用香草醛鹽酸法,測定7個氮素梯度處理的羽葉決明的莖、葉中縮合單寧(CT)含量,結(jié)果表明羽

3、葉決明葉片的CT含量明顯高于莖,而且CT含量隨著氮素施用量的增加而總體呈現(xiàn)下降趨勢,說明氮素對縮合單寧的生成有一定的抑制作用。在7個氮素梯度處理中,羽葉決明葉中的CT含量由14.78％逐步下降到1.14％;而羽葉決明莖中的CT含量的變化表現(xiàn)為,在低氮梯度處理中有所上升,在處理B達(dá)到峰值(4.62％),然后迅速下降并終維持在穩(wěn)定水平(0.98％～1.14％)。
　　 2、采用凱氏定氮法,測定7個氮素梯度處理的羽葉決明的莖、葉中粗蛋

4、白(CP)含量,結(jié)果表明羽葉決明葉片的CP含量明顯高于莖,但是隨著氮素施用量的增加CP含量并沒有大幅度的增加,只是略微有所上升,說明氮素對植株粗蛋白的含量沒有明顯的影響。在不同氮素梯度處理中,羽葉決明葉中的CP含量由18.52％增加到22.30％;而羽葉決明莖中的CP含量的增幅更小,7個氮素梯度處理中CP含量在5.73％～7.98％之間。
　　 3、采用連續(xù)監(jiān)測法,測定不同氮素梯度處理后羽葉決明莖葉植株鮮樣中二氫黃酮醇-4-還原

5、酶(DFR)的活性表明,DFR酶活性與縮合單寧含量呈顯著的正相關(guān)性(r莖=0.991,r葉=0.945)。葉中DFR活性從CK處理的310.1U/g下降到處理F的31U/g:莖中DFR酶活性同樣在低氮梯度處理中略有上升,之后從處理B的103.69U/g迅速下降并維持在穩(wěn)定水平(約50U/g)。
　　 4、采用RT-PCR方法,克隆得到羽葉決明DFR基因的cDNA片段,長度為600bp,包含一個編碼200個氨基酸殘基的閱讀框,命名

6、為CnDFR。序列比對發(fā)現(xiàn),CnDFR編碼的氨基酸與其它植物DFR蛋白基因有很高的同源性。蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)的分析,推測CnDFR編碼蛋白,其理論相對分子質(zhì)量為22421.6Kda,預(yù)測pI值為5.23,理論分子式為C1014H1568N254O301S9,不穩(wěn)定系數(shù)為39.74,推測CnDFR編碼蛋白是一個相對穩(wěn)定的蛋白。
　　 5、采用實(shí)時熒光定量PCR,檢測不同氮素處理后DFR基因在莖葉中的表達(dá)差異。總體上DFR基因在莖葉